汉恒慢病毒/逆转录病毒操作手册文件下载


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慢病毒/逆转录病毒操作手册

一、慢病毒/逆转录病毒的分装与储存

1.收到汉恒生物慢病毒/逆转录病毒产品后,请先对慢病毒/逆转录病毒产品进行分装处理,建议20-50 μl/管。如1-2天内使用,则留足够量病毒4℃保存,余下慢病毒/逆转录病毒置于-80 ℃长期保存。

2.病毒可以存放于-80 ℃ 6个月以上;但如果病毒储存时间超过 6个月,建议在使用前重新测定病毒滴度。

3.反复冻融会降低慢病毒/逆转录病毒滴度:慢病毒/逆转录病毒滴度越低,冻融对滴度的影响越大,108 TU/ml的慢病毒/逆转录病毒冻融2次滴度没有显著性差异,第3次冻融开始,每冻融一次滴度降低约10%;滴度107 TU/ml滴度慢病毒/逆转录病毒,从第2次冻融开始,每次冻融病毒滴度下降10%-15%

二、慢病毒/逆转录病毒实验策略与关键知识点

(一)、慢病毒/逆转录病毒感染策略

慢病毒/逆转录病毒本身的病毒滴度不高,感染细胞时病毒消耗量较大。慢病毒/逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转,因此慢病毒/逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞,然后将细胞放大化培养。而不是直接大量感染。

注意:对于一些传代能力较差的原代细胞,比如BMSC等,建议采用腺病毒感染。 

(二)、慢病毒/逆转录病毒感染关键知识点

1)细胞准备:慢病毒/逆转录病毒建稳转细胞系前,请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。慢病毒/逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%60%间为宜。

2)感染细胞最佳MOI的测定:MOI(感染复数)是指每个细胞感染的病毒数。

慢病毒/逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞,其最适MOI各有差别,原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOIMOI一般以3, 10, 30, 100的比例递增进行梯度摸索。MOI梯度摸索建议使用96孔或48孔板进行,可节省病毒和细胞。

 3)助转剂polybrene的选择:实验证明,polybrene可提高慢病毒/逆转录病毒对大部分细胞的感染效率,但polybrene有一定的细胞毒性,不同细胞对polybrene的敏感度不同,polybrene最常用的工作浓度为58 μg/ml

注:微信扫码关注汉恒生物公众号,可查看汉恒生物针对不同细胞推荐的适合MOI范围以及polybrene适用情况。

4MOI对应病毒体积的换算(非常重要)

感染时细胞数(一般以传代计数细胞数×2计算)×MOI=病毒个数;则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。

比如第一天传代105细胞到24孔板一个孔,第二天长到2×105细胞,按照MOI=20计算,需加入病毒总量为2×105×20=4×106,按照慢病毒/逆转录病毒1×108 TU/ml的滴度,则加入的病毒体积数为(4×106)/(1×108TU/ml)=4×10-2 ml=40 μl

三、慢病毒/逆转录病毒感染细胞步骤:(1/2小体积感染法)

注:微信扫码关注汉恒生物公众号,观看汉恒生物慢病毒/逆转录病毒细胞感染实验操作教学视频。

1.感染前准备
    1) 按实验需要将细胞铺板(比如24孔板)37℃ 培养过夜。细胞数以第2天密度约40%60%间为宜。

2)从冰箱取出慢病毒/逆转录病毒并在冰上缓慢融化,待完全融化后开始病毒感染实验。

2. 目的细胞的感染(1/2体积4小时感染法)

吸去细胞原有培养基,加入1/2体积新鲜培养基,并往新鲜培养基里加入终浓度58μg/mlpolybrene(部分polybrene不耐受细胞除外),再根据选定的MOI值,换算对应的病毒原液体积,并按体积将病毒原液加入细胞中,摇匀

1/2体积4小时病毒感染体积

培养皿类型

表面积/cm2

1倍细胞培养基体积

1/2培养基体积

 96-well

0.3 cm2

100 μl

 50 μl

 24-well

 2 cm2

500 μl

250 μl

 12-well

 4 cm2

  1 ml

500 μl

 6-well

10 cm2

  2 ml

  1 ml

 60 mm

20 cm2

  4 ml

  2 ml

100 mm

60 cm2

 10 ml

  5 ml


        1)针对贴壁细胞,细胞中加入病毒液后直接置于37℃培养箱感染4小时。

若目的细胞是悬浮或半悬浮细胞,则需要通过平角离心转染法进一步促进病毒对细胞的感染性吸附,即将适量的病毒液加入细胞培养板后,封好口,放入平角离心机后,低速(500g)离心1 h,然后放入37 ℃培养箱中继续积感染3小时。

237℃培养箱中感染完毕后,取出细胞,直接往含病毒的培养基中加入另外1/2体积新鲜培养基(含终浓度58 μg/mlpolybrene,部分polybrene不耐受细胞除外)。

3)感染后第二天(约12-16小时),吸去含病毒的培养液,换上新鲜的完全培养液(不含polybrene),继续37 ℃培养。

4)感染72小时后,荧光显微镜检测GFP/RFP等荧光表达效率。

5)稳转株的初筛选:如病毒载体携带puromycin抗性,感染72小时后置换含适当浓度的puromycin13 μg/ml)的新鲜完全培养液,同时准备一组普通目的细胞(简称Blank组,其细胞数量、密度和病毒感染组细胞一致),加入等终浓度的puromycin。每2-3天换含puromycin的完全培养液一次,直到Blank组细胞被puromycin杀光。

6)稳转株的二次筛选与培养放大:将puromycin终浓度减半(简称:1/2 puro培养基)培养存活的病毒感染组的细胞(包括目的基因和对照病毒组),并在细胞长密到80%左右进行细胞传代,传代后的细胞为P2代稳转株,P2-P4代继续用1/2 puro培养基培养细胞,大量扩增细胞至4代,并大量冻存P4代的稳转细胞株,以备后续实验。

 

注:为保证实验结果的稳定性及可重复性,稳转细胞株的后续功能检测都用相同代数的稳转细胞株,尽量选择P4代冻存后3代内,即P7代以内的稳转株进行功能实验。附件

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