如何选择合适的病毒文件下载

 

病毒如何选择-腺病毒or慢病毒?

病毒的转导效率比常规真核表达载体高很多,因此特别适合于介导外源基因在难转染甚至无法转染的哺乳动物细胞中表达。现在常用的病毒有慢病毒、腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒,我们目前接的项目主要是做慢病毒和腺病毒,这两种病毒在提高基因表达量,缩短实验周期上各有优势,但是有时可能因为实验目的不同,需要选择合适的病毒进行实验研究,具体选择何种病毒要可根据这两种病毒各自的特点来决定:

慢病毒:

优点:

可以插入细胞基因组,稳定表达,持续时间长;  

包装周期短(一般要两个月);

缺点:

感染效率相对于腺病毒要低很多;

不能扩增,一次包装的病毒用完后如果再需要只能重新包装,成本高。

一次包装所得到的的病毒滴度也相对较低(10的8次方pfu/ml),不大适合直接用于动物实验;

腺病毒:

优点:

感染效率高,很多细胞都能达到近99%;

纯化后的腺病毒可以直接进行动物活体注射;

可以在体外扩增,每次使用完后,可以自己用包装细胞进行扩增,节约成本;

一次包装所得到的滴度较高(纯化后为10的11次方pfu/ml,未纯化的为10的10次方pfu/ml);

缺点: 

不整合到基因组,无法稳定表达;

表达时间相对于慢病毒较短(两三周这样)。包装腺病毒的周期会比慢病毒长一些(一般要两个半月),因为腺病毒包装过程相对较繁琐。

但是总体来说,对于很多实验来说,选择腺病毒优势更大,并且很多情况下腺病毒是可以替代慢病毒来进行实验的:

一、后续实验周期不太长(一个月内)。选择腺病毒比慢病毒效率更高,用慢病毒的话感染效率不会太高,效率高的话也就70%到80%这样,不能直接进行后续实验,需要筛选稳定细胞株,而筛选稳定细胞株时间至少需要两周时间,筛选过程不顺利的话,需要的时间更多,会耽误实验。而腺病毒感染效率高,很多细胞的效率可以达到99%以上,这样就不需要话费额外的时间筛选稳定细胞株,可直接进行后续实验,对于实验时间和精力上节省很多。

二、目的细胞感染难度大,且后续实验不需要建立稳定细胞株。对于这种情况,当然是强烈建议用腺病毒,不说腺病毒感染效率会高很多,成本上也会节省很多。比如神经细胞,慢病毒感染效率估计只有30%这样,要把感染上的细胞分选出来继续培养才能进行后续实验,但是很多神经细胞(肿瘤细胞除外)都是不可传代的,如果筛选后几乎剩不了多少细胞,可能就无法完成后续实验。但是如果用腺病毒就不会出现这样的情况,腺病毒感染效率会比慢病毒高很多(可以达到70%左右),这样筛选出来的细胞可以直接进行后续实验,节省了时间成本。

三、要进行动物实验。动物实验需要的病毒量大,且病毒的滴度要很高,这样才能达到最小体积注射足够的病毒的目的。这一点,慢病毒肯定没法做到,目前慢病毒能达到的最高有效滴度一般是108PFU/ml,但是注射一只小鼠所需的病毒量至少1x108PFU/ml,而一只大鼠至少需要109PFU/ml,这样包装一次的慢病毒只能用于一只动物,同时,用慢病毒的话,要大约1ml的注射体积才能达到动物所需的病毒量,这个体积的液体量对于动物体是有害的,尤其是注射脑部,动物是承受不住的,但是用腺病毒就不会出现这样的情况,腺病毒的滴度可达到1011PFU/ml,用于动物实验时,每只小鼠只需要1ul,而每只大鼠10ul这样既可,一次包装的腺病毒足以完成一次动物实验研究,同时腺病毒可以扩增的,一次包装的腺病毒用完后不需要重头再次包装,而只要再扩增纯化即可,这样在经济成本和时间成本上都会节省很多。

为了更好的突出腺病毒在成本上比慢病毒的优势,我们用六孔板换算法可以更直观的看出腺病毒用于实验研究在经济成本上的优势。

以下为说明(过表达情况,因为病毒库都是过表达库)

汉恒生物慢病毒/腺病毒感染复数(MOI)与体积对应表

规格

大约数目

MOI值

加入病毒数量

慢病毒

腺病毒

96well

2-5×104

20-50

0.4-2.5×106

4-25ul

0.1-0.5ul

48well

1-2×105

20-50

0.2-1×107

20-100ul

0.5-2ul

24well

2-3×105

20-50

0.4-1.5×107

40-150ul

1-3ul

12well

5×105

20-50

1-2.5×107

100-250ul

2.5-5ul

6well

1-2×106

20-50

0.2-1×108

0.1-1ml

5-20ul

35mmdish

1-2×106

20-50

0.2-1×108

0.1-1ml

5-20ul

60mmdish

2-4×106

20-50

0.4-2×108

0.4-2ml

10-40ul

100mmdish

6-10×106

20-50

1.2-5×108

1.2-5ml

30-80ul

150mmdish

1-2×107

20-50

0.2-1×109

2-10ml

50-200ul

腺病毒滴度以1010/ml为准,其他滴度需相应换算;慢病毒滴度以108/ml为准,其他滴度需相应换算;
大约细胞数目是根据80%~100%细胞密度估算而出,具体细胞数请种细胞时进行细胞计数

 

以上表6孔板为例,一个孔慢病毒大约加入200ul,即使是减半,也需要100ul,而腺病毒大约加入5ul,按照每个产品提供1ml规格,则慢病毒用10个孔,腺病毒用200个孔。

定价及单价换算如下表格:

6孔板

腺病毒

慢病毒

每孔感染价格-定制服务

定制按照13000¥/基因 算,75¥/孔

定制按照10000¥/基因算,1000¥/孔

每孔感染价格-现货服务

现货按照6500¥/基因 算,32.5¥/孔

现货按照6500¥/基因 算,650¥/孔

公司后续扩增/包装服务

扩增按照1800¥/基因 算,9¥/孔

后续包装按照6500¥/基因 算,650¥/孔

 

因此,腺病毒现货30¥/孔,加上半年内免费扩增一次,就是说

腺病毒现货,感染六孔板细胞,仅需15¥/孔,亲,15¥/孔哦!!!

这个口号足以概括腺病毒的大部分优点,直观,吸引学生和老板。

附:各种病毒载体感染目的细胞操作区别

 

腺病毒

慢病毒

逆转录病毒

感染方式

直接加入

直接加入

直接加入

换液时间

感染后24h

感染后24h

感染后24h

是否需要筛选

不需要,腺病毒感染能力很强

需要筛选获得稳定感染株,慢病毒的感染能力不强

需要筛选获得稳定感染株,逆转录病毒的感染能力不强

观察时间

如带有GFP等荧光标签,24h后可观察到荧光,36h可达到表达高峰,若不带有荧光标签,则需要鉴定

带有GFP等荧光标签,24h后可以观察到表达,36h达到高峰,若不带有荧光标签,则不可直接观察到,需要鉴定

带有GFP等荧光标签,24h后可以观察到表达,36h达到高峰,若不带有荧光标签,则不可直接观察到,需要鉴定

是否需要助转剂

不需要

有时需要,但是根据具体情况操作,因为助转剂,如polybrene,对细胞的伤害比较大,有的细胞可能承受不了

有时需要,但是根据具体情况操作,因为助转剂,如polybrene,对细胞的伤害比较大,有的细胞可能承受不了

除了根据实验要求和目的进行不同病毒的选择外,但是对于同一种病毒往往会有多种病毒表达载体,有的带荧光,有的不带荧光,有的带GFP或者RFP,有的带luciferase,还有的是条件控制性载体,具体选择什么样的病毒载体也是要根据特定的实验目的进行选择,可依据以下几条进行选择:

① 像EGFP这样的荧光蛋白特异性不好,不是特异的在某一类细胞中表达,对于想获得特定的细胞,如做动物在体成像实验时,得到的信号可能会比较乱,建议不选用带有EGFP荧光标记的载体,可用用其他报告基因如luciferase或者RFP。

② EGFP的激发光波长为480nm左右,如果是细胞实验,后续是想要做细胞增殖或者凋亡细胞,后面会需要通过FITC (激发光波长为488nm)进行观察,这样会造成冲突,不容易观察。另外,当后续细胞实验要做到血液/组织液中LDH 检测、PI染核的流式检测细胞周期实验、Ki67免疫荧光实验、Brdu渗入实验、MTT/CCK8等需要用到激发光的实验,其中用的病毒也是不能用GFP标记,因为他们用到的激发光波长和GFP相似,这样可能会干扰实验结果。

③ 免疫荧光等试验时,如果要研究两个蛋白的相互作用,需要两种荧光,而带有荧光标记的抗体会减少了一个可用的激光通道,这种情况下,只可以其中一个病毒带有荧光标记或者两个病毒都不要带荧光标记,这样方便后面使用带有荧光标记的抗体进行检测。

④ 研究两种蛋白相互作用,还可以选择荧光素酶标记作为报告基因,可以选择两种不同的荧光素酶,后续用生物学方法检测计算即可。

 

 
资料分类: