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microRNA研究策略

MicroRNAmiRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,几个miRNAs也可以调节同一个基因。可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。据推测,miRNA调节着人类三分之一的基因。MicroRNA存在多种形式,最原始的是pri-miRNA,长度大约为300~1000个碱基;pri-miRNA经过一次加工后,成为pre-miRNAmicroRNA前体,长度大约为70~90个碱基;pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后,成为长约20~24nt的成熟miRNA

microRNA(以下简称mir研究策略:

功能模型芯片筛选-QPCR验证-mir基因靶向操作-功能验证-寻找靶标与靶标蛋白内源性验证-靶标蛋白外源性luciferase-3’UTR验证-靶标回复实验(rescue实验)

1. 功能模型芯片筛选:选用有功能差异对比的样本,进行mir芯片筛选(mir-array),筛选出变化明显的mir

现在主流的芯片平台是AgilentAffymetrixAgilent只检出成熟体,而Affy的芯片前体和成熟体皆检出,假阳性率较高,但Affy的容量相比Agilent的大很多。

汉恒生物Hanbio)提供AgilentAffymetrix平台的mirarray筛选服务及后续的芯片数据分析及靶基因聚类分析。

2. 芯片结果QPCR验证:用与1中相同的样本,对1中筛选出的mir进行QPCR验证,挑选出丰度高且变化显著的mir(以下简称mir-X)。

MirQPCR验证最首选的当然是LifeTaqman系列探针和kit,权威,但价格极其昂贵。与之相比,特定引物SYBR法检测mir价格适中,但误差率较高。

汉恒生物Hanbio)特有一步反转技术,特异性好,简单易用。汉恒已开发出针对不同种属mirmiRNA快速检测技术MiRQeasy,与市面一般的mir引物相比,信号更单一,且操作极其简便。汉恒独有MiRTeasy一步法反转录试剂,一次性转录,兼顾了专一性和通用性。

3. MicroRNA基因操作

原则:

mir变化相反的处理是否取缔功能表型的变化,而同向mir变化处理是否能模拟出功能表型变化。比如我们发现mir-X在细胞某种诱导分化后升高,则诱导时取缔这种升高是否会抑制分化,而单单升高该mir能否模拟出细胞分化表型。

1) 初筛选:

选取出若干芯片与QPCR验证变化一致,且组织表达丰度较高的Mir,运用Mimics(过表达)和inhibitor(封闭)分别在细胞中过表达和封闭特定的mir,观察细胞功能的变化。

注:Mimicsinhibitor表达时程很短,一般72-96小时,所以一般只作为初筛。

2mirAnti-mir的克隆高表达:

Mir过表达:从miRbase上调出pri-mir序列,直接克隆pri-mir至表达载体。

Mir下调:构建mir的下调即封闭,主要的技术是sponges技术。将若干段连续mir成熟序列互补序列串联,使之在细胞内表达,吸附目标microRNA,所以称之为sponges(海绵)。

汉恒生物Hanbio)已开发并完善病毒载体介导的microRNA过表达和封闭技术平台,可针对不同的microRNA不同的实验要求为客户提供定制服务。您也可直接购买我们已经构建好的microRNA病毒颗粒或病毒载体。

3Transgenic & Knockout 

如果想考察microRNA在机体发育中的特定作用,Transgenic TG& Knockout KO mice 肯定是最好的选择。此外,斑马鱼由于其周期短,鱼身透明等特点,也为microRNA功能研究提供了很好的便利。

汉恒生物Hanbio)与各转基因研发中心有长期合作关系,并已拥有部分已构建好的microRNA TGKO小鼠,详情可咨询汉恒生物销售人员。

4. 功能验证:

在目的细胞(病毒法)或者动物脏器(转基因小鼠)中高表达mir-X,观察细胞或动物的功能表型,具体功能表型依照各方向类别而不同,如细胞分化,则观察分化率等,如肿瘤,可参考《汉恒生物肿瘤学功能研究概述》技术文件,也可来电来信与我们的实验技术工程师交流。

5. 寻找靶标与靶标蛋白内源性验证:

   1)靶基因的预测:生物信息学比对

目前通过生物信息学比对找出特定microRNA对应可能的靶点蛋白主要有以下几个引擎:

a. PicTar:基于microRNAmicroRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA靶基因。假阳性率也较低。Rajewsky实验室开发的。网址:http://pictar.mdc-berlin.de/

b. targetScan: 基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率较低的软件。Bartel实验室开发的。

网址:http://www.targetscan.org/

c. iRTarBase:整合实验证实的microRNA靶标的数据库。

其他数据库可自行google,不一一在此列出。

网址:http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html

2)表达谱芯片:

如果有条件,将样本中做mirarray同时,进行表达谱芯片分析,然后通过生物信息学预测与表达谱芯片结果交叉比对,可得出把握度大的候选靶基因。

3)靶标蛋白的初步验证:

一般有候选的2-4个靶标蛋白为指标,应用mir基因靶向操作的细胞或组织样本进行靶标蛋白的western验证,从中找出和mir-X趋势相反且变化最明显的1-2个靶标。

6. 靶标蛋白外源性:   

5中确定的靶标蛋白基因3’UTR区克隆至luciferase报告基因载体(如下图,psicheck-2,最常用的microRNA报告基因载体,promega公司产品),并与mir-X共转293T细胞,验证mir-X转入后luciferase的信号下调效率,进一步确定靶标。为了实验的严谨性,可加入靶标基因3’UTRmicroRNA预测结合区域的突变体作为对照,进一步说明问题。

 

7. 靶标回复实验(rescue实验):(可选做)

一个microRNA有很多靶基因,那么在我们的模型中,我们研究的microRNA是否是通过对我们关注的靶基因的调控,起到了对功能表型的影响?为了进一步说明这个问题,靶标蛋白功能回复实验(rescue实验)的重要性不言而喻。说选做,是由于工作量大,单单做到外源性验证已经可以发表SCI paper

Rescue实验的原理:3mir基因操作模型中,一般情况下microRNA与靶蛋白都是反向变化的。即过表达mir都导致靶蛋白的下调,而封闭mir有可能导致靶蛋白的表达升高注:封闭mir导致靶蛋白升高也有很多例外,首先,可能本底该mir的表达量并不高,也不会对靶蛋白的量有太大影响;再次,microRNA对靶基因的调节都是比较温和的,而不像外源的siRNA

方法:在过表达mir-X时,同时过表达靶标蛋白,或者在mir-X封闭的条件下,同时干扰靶标蛋白,如果我们在这个基础上,再过表达靶蛋白,如果细胞或者动物在功能上重新回归或者部分恢复到对照水平,则充分说明mir-X是通过或部分通过该靶蛋白通路,影响了功能表型。

注:生物体内上下游信号通路错综复杂,很难只改变一种因素就把生物体回归到正常,所以部分恢复也是很有意义的。

 

Reference

1. Lagendijk AK, Goumans MJ, Burkhard SB, Bakkers J. MicroRNA-23 Restricts Cardiac Valve Formation by Inhibiting Has2 and Extracellular Hyaluronic Acid Production. Circ.Res. 2011;109:649-657.

2. Aranha MM, Santos DM, Sola S, Steer CJ, Rodrigues CM. miR-34a Regulates Mouse Neural Stem Cell Differentiation. PLoS.One. 2011;6:e21396.

3. Schraivogel D, Weinmann L, Beier D et al. CAMTA1 is a novel tumour suppressor regulated by miR-9/9(*) in glioblastoma stem cells. EMBO J. 2011

4. Cao Q, Mani RS, Ateeq B et al. Coordinated Regulation of Polycomb Group Complexes through microRNAs in Cancer. Cancer Cell 2011;20:187-199.

 

 

 
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