Mir前体克隆文件下载

Mir前体克隆步骤

 

1、首先进入mirbase网站http://www.mirbase.org/

mirbase网站2search需克隆的mir(以has-mir-143为例)

   如下图找到工具栏的“search”按钮,单击进入:



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

在接下来弹出的对话框中输入hsa-mir-143,单击“提交查询内容”

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

弹出以下画面:

 

 

 单击Stem-loop中的按钮即可获得所需的hsa-mir-143前体序列


单击Genome context 


 

 

在弹出的画面中单击即可获得mir所在的基因组信息。

3、获得mir前体基因组序列并克隆

克隆的时候一般往上下游推。如下图:上下游各300bp,一般长一点短一点都可以,总长度300bp以上就差不多:


单击即可获得mir前体基因组序列。

以此序列为模板,primer5设计引物并加入酶切位点(设计引物时,最好将mir前体序列置于整个PCR目的产物的中部附近,不要太靠近PCR目的产物的末端)

4、设计好的引物还可以在NCBI验证其准确性

hsa-mir-143为例,设计好的引物如下:

ForwardGGTCAAGGTTTGGTCCTGGGTGCTC

ReverseAGGGTGCTGGGGAAATGCTAACGCC

首先进入NCBI网站主页


单击按钮,进入Basic BLAST页面

 

单击按钮,进入如下界面,并将上述设计好的引物输入方框内,如下图选择

 

单击按钮:如下图所示,第一个全绿色的是与上述引物完全匹配的基因组,其余颜色均不完全匹配。

 

这时只要查询这个对应的基因组是否为hsa-mir-143前体序列即可。

 

 
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