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细胞功能分析研究整体方案

一、 增殖实验

1、MTT/CCK8

(a)、MTT

    MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜,用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值),来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。

 

实验步骤:

1、接种细胞

用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul。

2、培养细胞

同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

3、呈色

培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。

4、比色

选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

注意事项

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系

IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!

 

 

(b)CCK-8检测细胞增殖

 

CCK-8(cell-counting kit-8)检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原,WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。且WST-8相较XTT和MTS化学性状更稳定, 因此实验结果相对更加稳定。此外,WST-8相较MTT、XTT,线性范围相对宽,灵敏度更高。 
     当细胞增殖得越多越快,则formazan产生量越多,颜色越深;反之,当内外因造成的细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖(活性)相关数据。

 

实验步骤:

 

实验(一):细胞活性检测

 (1)、在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5% CO2)。

(2)、向每孔加入10 μL CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

(3)、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

(4)、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

(5)、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。

 

实验(二):细胞增殖-毒性检测

(1)、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(37℃,5% CO2)。

(2)、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。

(3)、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。

(4)、向每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

(5)、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

(6)、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

(7)、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。

注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

 

活力计算:

细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100
A(加药):具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0加药):具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力

 

2BrdU 渗入实验(需要标记FITC,和GFP一般不兼容)

 

    细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。

    测定细胞周期的方法很多,有同位素标记法、细胞计数法等,这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。

 

实验步骤

   1、细胞生长至指数期时,向培养液中加入BrdU,使最终浓度为10μg/ml。

   2、44小时加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。

   3)、48小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

    (4、常规染色体制片。

   5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2×SSC液,距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。

   6、弃去2×SSC液,流水冲洗。

   7、Giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。

   8、镜检100个分裂相,计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

   9、计算:细胞 周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小时)

附:(1)BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。

    (2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,柠檬酸三钠•2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存。

 

3、Ki67 免疫荧光实验(需要标记荧光,和GFP/RFP 等荧光标记一般不兼容)

 

    Ki67蛋白是细胞周期相关的一种核蛋白,主要表达于细胞增殖分裂的各个时期(G1、S、G2和M期),但是在静息的细胞(G0期)中不表达。Ki67常用于检测肿瘤细胞的生长指数(免疫组化法利用计算细胞总数中的Ki67阳性细胞数所占比例得到Ki67指数)。

    Ki67通常通过标记抗Ki67的抗体(FITC绿色荧光)和DNA染料碘化丙啶(PI,红色)而利用流式细胞仪检测来实现对细胞周期的检测。

 

实验步骤

1、在最适的环境下培养细胞。

2、除去培养液,用PBS洗一次。

3、胰蛋白酶处理和收集细胞。

4、可渗透化处理细胞:用0.3 ml PBS轻轻的重悬细胞, 然后慢慢加入0.7 ml预冷的100%乙醇。用1 ml玻璃移液管小心的混匀。在4°C至少1h。(注意2)

5、沉淀细胞,完全吸取上清。

6、加入 0.5 ml 2N的HCl含0.5% Triton X-100,室温孵育30 min。

7、沉淀细胞并且移去上清,用0.5 ml 0.1 M四硼酸钠重悬细胞2 min,沉淀细胞。(注意3)

8、用150 μl PBS/1 % BSA洗细胞一次。

9、用50μl 0.5% Tween-20/1%BSA/PBS重悬细胞,加10-20μl (1μg/106 cells) Ki67(mAb,1:100)在室温下孵育一个小时。

10、沉淀细胞用 150μl PBS/ 1 % BSA.洗一次。

11、沉淀细胞用 50μl 0.5% Tween-20—1%BSA/PBS重悬,加5μl (1μg/106 cells),羊抗鼠二抗-FITC,室温下孵育30分钟。

12、沉淀细胞转移至FACS管子。

13、用含有10μg/ml RNase A和20μg/ml碘化丙啶(PI母液)的0.5 ml PBS重悬细胞。

14、避光使细胞在室温下孵育半个小时。

15、FACS检测或者储存于 4OC。(注意4)

 

注意事项

1、所有的沉淀细胞步骤为4,000 rpm, 2 min。

2、可渗透化处理细胞后细胞浓度大约为106 ,样品可以4°C储存于乙醇中到2个星期。

3、流式细胞检测时需要设立对照试验:

1)只用PI染细胞

2)Cells设置阴性对照组不加药。

 

4、Cellcycle 流式细胞检测实验

 

    原理: 通常用PI染细胞核,PI在一定波长的光下发出荧光,其强度与DNA含量成正比。绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白及其它发光基团也可作为标记物,分选细胞。

 

实验步骤

1)将细胞以1×106接种于60mm培养板,80%汇合后转染。

2)24小时后在新鲜培养液中加入适当的抗生素(真核表达载体上的抗性标记)进行培养(该步可选)。

3)48-72小时后用胰酶消化收集细胞,PBS洗两遍,弃上清,加入1ml 70%预冷乙醇中,吹打均匀,4℃固定12小时以上。

4)PBS洗涤去乙醇,1000rpm, 5min,洗两遍。

5)0.5 mlPBS重悬细胞,加入PI和 RNaseA至终浓度50µg/ml,37℃ 温浴30 min。

6)用流式细胞仪测定周期。

PI:碘化丙啶,以PBS配成1mg/ml,4℃保存。
RNaseA:10mg/ml

 

5、克隆形成实验 colony forming assay---细胞生长状况有关指标的检测方法

当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞,大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。

 

实验方法:

 

平板克隆形成试验软琼脂培养克隆形成试验

1、平板克隆形成试验:本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞

2、软琼脂培养克隆形成试验:本法适用于非锚着依赖性生长的细胞,即悬浮细胞适用,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。

 

1、平板克隆形成试验

基本步骤:


(1)取对数生长期的单层培养细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。
(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释,以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37 5% CO2及饱和湿度的环境下,静置培养2~3周。
(3)经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL,固定15分钟。然后去固定液,加适量Giemsa应用染色液染10~30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。
(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。
                  克隆数
    克隆形成率= —————×100%    
                 接种细胞数
平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。

2、软琼脂培养克隆形成试验

基本步骤:


(1)取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40中不会凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL),冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37 5%CO2温箱中培养10~14天。
(5)把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数。计算形成率。
软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验。

 

软琼脂克隆软琼脂克隆

注意事项:

 

 (a) 琼脂对热和酸不稳定,若反复加热,容易降解而产生毒性,且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装;

 (b) 细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度,否则结果的准确度会受到很大影响;

 (c) 软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃,否则将会烫伤/死细胞;

 (d) 接种时细胞密度适度,不可过高。

    细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养,生存率明显下降,永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上,但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%,甚至无法形成单个克隆。因此,为了提高克隆形成率,有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。

    细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大,一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系,做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在碟皿中,持续一周,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养。

 

 

二、 凋亡实验

 

1、流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI双染色法(早期凋亡,需要标记FITC,和GFP 一般不兼容)

    细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

实验步骤

1)、细胞收集:悬浮细胞直接收集到10 ml的离心管中,每样本细胞数为(1-5)×106,/mL 500-1000r/min离心5 min,弃去培养液。
2)、用孵育缓冲液洗涤1次,500-1000r/min离心5 min。
3)、用100ul的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育10-15 min。
4)、500-1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。
5)、加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不时振动。
6)、流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI。
7)、结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。 

2TUNEL 法检测细胞凋亡(晚期凋亡)

   一般采用Roche TUNEL细胞凋亡检测试剂盒,需要标记FITC,和GFP 一般不兼容。TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的荧光素抗体特异性结合,后者又与HRP底物二氨基联苯胺(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3‘-OH形成,很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

 

器材与试剂

 

器材:光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等;

试剂:试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP;自备试剂:PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(临用前配制,5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS)、Proteinase K工作液(10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8)或细胞通透液(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate,临用前配制)、苏木素或甲基绿、DNase 1(3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl,pH 7.5, 10 mM MgCl2,1 mg/ml BSA)等。

 

实验步骤

操作流程图:制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。

 

具体操作步骤:

(1)、 用二甲苯浸洗2次,每次5min;

(2)、用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;

(3)、PBS漂洗2次;

(4)、用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21-37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;

(5)、PBS漂洗2次;

(6)、制备TUNEL反应混合液,处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液,阳性对照组先加入100μl DNase 1,反应在15-25℃×10min,后面步骤同处理组。

(7)玻片干后,加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。

(8)、PBS漂洗3次;

(8)、可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm,检测波长为515-565nm);

(10)、玻片干后加50μl converter-POD于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。

(11)、PBS漂洗3次;

(12)、在组织处加50-100μl DAB底物,反应15-25℃×10min;

(13)、PBS漂洗3次;

(14)、拍照后再用苏木素或甲基绿复染,几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

(15)、加一滴PBS或甘油在视野下,用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200-500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小,胞膜完整但出现发泡现象,晚期出现凋亡小体,贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落;而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化,核膜裂解,染色质分割成块状/凋亡小体)

 

注意事项:

(1)、进行PBS 清洗时,每次清洗5 min。

(2)、PBS清洗后,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。

(3)、在载玻片上的样本上加上实验用反应液后,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止反应液干燥造成实验失败。

(4)、TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。

(5)、如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色,则不可使用,需重新配制。

(6)、用甲基绿(Methyl Green)染液(3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0)染色后,请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净(100%乙醇)、脱水(二甲苯)透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80-90%的乙醇洗净时,甲基绿比较容易脱色,注意快速进行脱水操作。

(7)、荧光素标记的dUTP液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物,可通过吸入、口服等途径进入机体,注意防护。

(8)、试剂保存;未打开的试剂盒贮存在-20℃(-15-25℃);converter -POD液一旦解冻,以后就保存在4℃(2-8℃)下,至少在6 m内稳定,避免再次冻存;TUNEL反应液临用前配好后,放至冰上直至使用。

(9)结果分析时注意:在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断,从而引起假阳性结果;而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全,以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应,进而产生假阴性结果。

 

3、 Caspase3/8/9 Western Blot 检测

 

Caspase3

    Caspase是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase3也称CPP32,是细胞凋亡过程中的一个关键酶,可以剪切procaspase 2、6、7和9,并可以直接特异性剪切许多caspase底物,包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase),ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease),gelsolin和fodrin等。这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用,包括染色质固缩,DNA片段化等。同时caspase 3对细胞起泡(Cell blebbing)也起到关键作用。

    检测原理基于casepase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline),从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。pNA在405nm附近有强吸收。参照黄色产物pNA制作的标准曲线,可以作为定量caspase 3酶活性的标准品。

 

Caspase-8

    Caspase 8通常以酶原的形式存在,在细胞凋亡的信号转导过程中被激活,Caspase 8被认为是细胞凋亡信号转导过程中上游的caspase,在Fas-receptor和TNFR-1介导的细胞凋亡过程中caspase 8被激活,形成一个由p18和p10组成的二聚体,进一步激活下游的caspase 4,caspase 6,caspase 9和caspase 10。 

    本方法基于Caspase 8可以催化底物Ac-IETD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline),从而可以通过测定吸光度来检测Caspase 8的活性。pNA在405nm附近有强吸收。 检测样本的405nm OD值参照pNA制作的标准曲线,可以计算样品的Caspase 8酶活性。

 

Caspase-9

    Caspase 9也称ICE-LAP6 或Mch6,是细胞凋亡信号转导过程中上游的caspase。线粒体释放细胞色素c以后,caspase 9可以和细胞色素c以及Apaf1形成复合物,同时被激活。激活的caspase 9可以激活细胞凋亡的最关键酶caspase 3,从而促进后续的细胞凋亡信号。Caspase 9的激活可以通过磷酸化进行调控。

    本方法基于Caspase 9可以催化底物Ac- LEHD -pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline),从而可以通过测定吸光度来检测Caspase 9的活性。pNA在405nm附近有强吸收。 检测样本的405nm OD值参照pNA制作的标准曲线,可以计算样品的Caspase 9酶活性。

 

凋亡因子Caspase-3/8/9检测样本准备:

 

1)细胞样品:取1×107个细胞(约1个T25的培养瓶细胞量),600g4℃离心5分钟收集细胞,小心吸除上清,PBS洗涤一次。吸取上清后,每管细胞样品加入100ul裂解液重悬沉淀,冰浴裂解15分钟。4℃ 16,000g离心10-15分钟,把上清转移到冰浴预冷的离心管中。立即测定caspase 3的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度,尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml。

2)组织样品:约每10mg组织加入100ul裂解液,在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中,冰浴再裂解5分钟。4℃ 16,000g离心10-15分钟,把上清转移到冰浴预冷的离心管中。立即测定caspase 3的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度,尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml。

凋亡因子Caspase-3/8/9检测

                        

 

4、DNA ladder法检测细胞凋亡(现在极少用)

    发生细胞凋亡时,内源性核酸酶被激活,染色体DNA链在核小体之间被切割,形成180~200个碱基或其整数倍的DNA片段,将这些DNA片段抽提出来进行电泳,可得到DNA梯状条带(DNA ladder)。

一、材料与试剂

凋亡细胞;蛋白酶K(500μg/ml)8mol/L 醋酸钾

白细胞裂解液:pH8.0,10mmol/L Tris-HCl,10mmol/L NaCl,10mmol/L EDTA,1% SDS。

氯仿无水乙醇70%乙醇;2%琼脂糖凝胶。

 

实验步骤

(1)、收集凋亡细胞:取1~2×106 个细胞,离心后,立即用70%酒精(-20℃)固定2h;

(2)、洗涤:取出酒精固定的细胞,1000r/min离心5min ,去掉上清液,PBS洗二次;

(3)、裂解细胞:加400μl细胞裂解液,充分混匀再加蛋白酶K100μl,置65℃水浴消化2小时或过夜;

(4)、蛋白处理:加75μl 8mol/L的醋酸钾,4℃15min,再加750μl氯仿,充分混匀后,10000r/min离心10分钟后,将上清移至一新的Eppendorf管中;

(5)、沉淀DNA:加入750μl无水乙醇,上下轻柔颠倒混合,即可见乳白色沉淀,若不明显时可置-20℃过夜,12000r/min离心10分钟,去上清;

(6)、洗涤DNA:加1ml 70% 乙醇,混匀,10000r/min 离心5min,去上清;

(7)、溶解DNA:根据 DAN 沉淀的大小,加一定量的蒸馏水或TE,37℃溶解;

(8)、测定DNA浓度;

(9)2%琼脂糖凝胶电泳80V 2小时;

 

结果判断

    出现梯状电泳条带,最小的条带为180-200 bp,其他的条带为其整倍数大小。坏死细胞则出现弥散的电泳条带,无清晰可见的条带。正常细胞DNA基因条带因分子量大,迁移距离短,故停留在加样孔附近。

5、彗星实验(现在极少用)

    

    彗星分析(comet assay)又称单细胞凝胶电泳分析( Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) 1984 年起用于检测的真核细胞的DNA 断裂和修复,具有方法灵敏、快速优点,同时既可以定性又可以定量,目前DNA 损伤检测的其他方法(Giemsa 染色法,TUNUL 法、DNA 电泳梯度法、流式细胞检测法)是无法比拟的。彗星实验为检测细胞内DNA损伤分析提供简便有效的方法。自成功地用于检测DNA单链断裂以来,经不断地改进,已成为一种快速、灵敏和简便地检测DNA损伤地方法,广泛地应用于DNA放射损伤、DNA剪切损伤、DNA交联的检测、药物的遗传毒性评价和细胞凋亡鉴定等工作中。 彗星分析的检测原理是基于变性的原理。各种因素诱发细胞DNA损伤后会影响DNA的高级结构,使其超螺旋松散。这种细胞经过实验中细胞原位裂解(碱裂解)、DNA解链等过程后,电泳时损伤的DNA从核中溢出,朝阳极方向泳动,产生一个尾状带,未损伤的DNA部分则保持球形,二者共同形成 “彗星”。在一定范围内,”彗星”的长度(代表DNA迁移距离)和经荧光染色或银染色后,”彗星”荧光强度或光密度(代表DNA的量)与DNA损伤程度相关,因此可以定量检测单个细胞中的DNA损伤。

 

实验步骤: 

(1)、各种细胞用冰冷的PBS 洗一次,离心收集,用PBS 重悬,密度为1×10

4-5个/ml。 

(2)、铺胶:下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。 

(3)、第1 层凝胶的制备:将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA),冷至45-60℃,取适量铺于载玻片CometSlide上,再置4℃下10min 使NMA 凝固。也可以先铺胶,晾干后无尘存放,1周内使用(据经验,此法较优)。 

(4)、第2 层凝胶的制备:低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化,冷至37℃(可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃,低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时)。将20μL 细胞(约 104个)和75μL的LMA 混合均匀。然后,迅速将适量含细胞的LMA 滴到第1 层琼脂糖上,立即盖上另一干净盖玻片,置4℃10min 使第2 层LMA 凝固。注意,使用盖玻片的目的是使琼脂糖平整,显微镜下方便观察,经验丰富者,可以不用,也可以达到好效果。 

(5)、第3 层凝胶的铺制::第2 层LMA 凝固后,在室温下小心移去盖玻片,重复第二层的步骤。(此步可以不作,一般铺一层细胞就足够) 

(6)、细胞裂解: 移去盖玻片,将玻片置于平皿中,轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液(配制见试剂使用说明的1,2)。4℃下裂解1-3h。取出载玻片用蒸馏水漂洗2次,要求动作轻柔,以免琼脂糖脱落。 

(7)DNA 碱解旋: 将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻片胶面0.25cm 左右,室温放置20min,以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段,使DNA 断链在电场中易于迁移。 

(8)、细胞电泳: 电压15-25V,电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节,电泳时间为10-20min。建议预实验,摸索最佳的电压、电流及时间。 

(9)电泳后将载玻片置于平皿内。加入蒸馏水,漂洗2次,每次5min,弃去蒸馏水,每载玻片加2-3滴染色剂,盖上盖玻片(也可以不盖上),避光染色10min。盖上盖玻片的目的是可以隔日分析,或便于操作。 

(10)、观察、拍照和分析: 荧光显微镜515-560nm (绿光)波长的激发光,可清楚地观察到核DNA 和迁移的DNA(即慧星尾)。色泽和图像十分精美,每个样本随机选择20-100 个细胞,图片保存后,用相应的软件分析结果。 

 

注意事项:

    加入液体和弃除液体动作轻柔,最好用吸管操作。染色时应戴手套。如果购买的试剂盒中无载玻片CometSlide,则自备载玻片,试验过程相同。 

 

三、 迁移、侵袭实验

1. 划痕实验

    细胞划痕(修复)法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法,类似体外伤口愈合模型,在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上,用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线,去除中央部分的细胞,然后继续培养细胞至实验设定的时间(例如72h),取出细胞培养板,观察周边细胞是否生长(修复)至中央划痕区,以此判断细胞的生长迁移能力,实验通常需设定正常对照组和实验组,实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别,通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力,可以判断各组细胞的迁移与修复能力。

 

特点:细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法,实验成本低,可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。与transwell相比,细胞划痕实验具有经济、操作方便等优势。

 

 

材料

 6 孔板(其他的也可以,但感觉6孔比较好,大小适中)、marker笔直尺、20微升枪头(灭菌)、无血清培养基、PBS

 

实验步骤

    所有能灭菌的器械都要灭菌,直尺和marker笔在操作前紫外照射30min(超净台内)

1)、先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀得划横线,大约每隔0.5-1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。

(2)、在空中加入约5X105个细胞,具体数量因细胞不同而不同,掌握为过夜能铺满。

(3)、第二天用枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜。

(4)、用PBS洗细胞3次,去处划下的细胞,加入无血清培养基。

(5)、放入37℃ 5% CO2培养箱,培养。按0,6,12,24小时取样,拍照。

 

注意事项:

    一般做划痕实验,都是在无血清或者底血清状态下培养的,否则细胞增殖就不能忽略。按照6孔板背后画线的垂直方向划痕,可以形成若干交叉点,作为固定的检测点,这就解决了前后观察时位置不固定的问题。

 

 

3. Transwell 实验检测侵袭(需要Matrigel

    细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

 

材料准备:

可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)

 

实验步骤:

(1)、基质胶铺板:

用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。

(2)、制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。

(3)、接种细胞

①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

② 24孔板下室一般加入600µl含20%PBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

(4)、结果统计

直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。

取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。

0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。

400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。

 

实验周期:1个月

 

2Transwell 实验检测迁移(不需要Matrigel基质胶)

细胞迁移(cell migration)指的是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。过程中细胞不断重复着向前方伸出突足,然后牵拉胞体的循环过程。细胞骨架和其结合蛋白是这一过程的物质基础,另外还有多种物质对之进行精密调节。移动过程中,细胞不断重复着向前方伸出突触,然后牵拉后方胞体的循环过程。细胞骨架和其结合蛋白,还有细胞间质是这个过程的物质基础,另外还有多种物质会对之进行精密调节。细胞迁移是通过胞体形变进行的定向移动,因此细胞迁移的移动速度很慢。但此细胞迁移“步缓力微”的运动特性,却是细胞觅食、伤口痊愈、胚胎发生、免疫反应、感染和癌症转移等生理现象所涉及到的。因此细胞迁移是目前细胞生物学研究的一个主要课题,科学家们试图通过对细胞迁移的研究,在阻止癌症转移、异体植皮等医学应用方面取得更大成果。也因为细胞迁移独有的运动特性,成为今生物学热门研究方向。

Transwell:
    一类有通透性的杯状的装置;其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,杯子底层的一张有通透性的膜(一般为聚碳酸酯膜)。该膜微孔的大小在0.1-12.0µm之间。Transwell放入培养板后,分为两室:Transwell小室内称上室,盛装上层培养液;培养板内称下室,盛装下层培养液。上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
 
应用
    细胞种在上室内,因聚碳酸酯膜有通透性,故可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

 

实验步骤:

(1)Transwell小室制备
(a)无基质胶Transwell小室制备(迁移实验采用)
① 包被基底膜:
    用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话,一般配成0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。
② 水化基底膜:
    吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37℃,30min。
    另有方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。

(b)、有基质胶的Transwell小室制备(侵袭实验采用)
Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300µl预温的无血清培养基,室温下静置15-30min,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。

(2)制备细胞悬液
① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
② 消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为,对照组和处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

(3)接种细胞
① 取细胞悬液100-200µl加入Transwell小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200µl。
② 24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
③ 培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细胞,24h内对细胞增殖并无明显抑制,但24h后,抑制作用就开始出现了。所以,用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24h内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少,究竟是由于侵袭被抑制引起,还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MMPs表达,到最后释放到培养基中,还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外,我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张,是正常现象
    在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后1-2h把培养板从培养箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生。

(4)结果统计
检测穿过的细胞数有两种方法:
(a)直接计数法
“贴壁”细胞计数
    这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。

通过给细胞染色,可在镜下计数细胞
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 染色:常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。
    推荐采用0.1%结晶紫染色,这种方法有如下优势:(1). 不需要固定细胞,直接染色即可。(2). 配制简单方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脱色,将结晶紫完全洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值,间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为,虽然经过准确的细胞计数,往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制,可能某一批实验穿过的细胞会特别多,以致细胞成堆,这种情况下就难以计数了,这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意,染色前要将膜风干,否则可能会染不上。
③ 细胞计数:我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照,把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保存,但是这样做小室就成了一次性的了,未免有点浪费。
    取若干个视野计数细胞个数。一般采用3-5个视野,也有用10个,都是随机选取,个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性,也会掺进人为影响,特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野,不是随机选择,而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。

(b)、间接计数法
    间接计数法主要用于穿过细胞过多,而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法,与常用的MTT实验是同样的原理。

MTT法
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基,将小室置于其中,使膜浸没在培养基中,37℃ 4h后取出。
③ 24孔板中加入500µl DMSO,将小室置于其中,使膜浸没在DMSO中,振荡10min,使甲臜充分溶解。取出小室,24孔板于酶标仪上测OD值。
荧光试剂检测
    这类方法一般是与Transwell小室一起出售的,其原理与MTT法类似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解,检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。
结晶紫检测
     原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点,就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞,在脱色后还可重新染色。

 

 

四、 内皮成管实验

    通过 condition medium 或者coculture 模型,检测肿瘤细胞对内皮成管能力的影响:HUVEC Matrigel tube formation Model以下摘自文献---肿瘤条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖、黏附、迁移能力的调节

 

    肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特征之一,也是肿瘤临床治疗的难题。据报道,60% 以上的恶性肿瘤患者于初次诊断时已发现有转移。在临床肿瘤患者中,约有80%~90% 以上死于肿瘤侵袭和转移。

   肿瘤转移是一个多步骤、多环节、多因素参与的复杂过程,每个环节都受到多种因素的影响。人们一般习惯将整个肿瘤转移过程分为个步骤:(1)侵袭(invasion) :原发瘤细胞间同质黏附降低,部分肿瘤细胞从原发灶脱落,进而入侵邻近组织;(2)内渗(intravasation) :从原发灶脱落的肿瘤细胞穿过血管或淋巴管内皮,进入循环系统。在循环过程中它们需要逃避免疫监视,只有幸存的细胞才有可能参与下一步过程;(3) 外渗(extravasation) :幸存的肿瘤细胞在远端部位穿过毛细血管内皮;(4) 新的转移灶(secondary tumor) 形成:转移的肿瘤细胞在新的宿主部位增殖,最终形成新的转移灶。肿瘤细胞外渗是肿瘤转移的关键限速步骤,而内皮则是阻止肿瘤外渗过程中的第一道防线。恶性肿瘤的无限制侵袭性生长及其转移依赖于血管生成(angiogenesis),抑制血管生成能显著地抑制肿瘤的生长。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程,一般包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。肿瘤血管生成的发生一方面是由于肿瘤细胞释放血管生成因子激活血管内皮细胞,另外一方面也是因为内皮细胞旁分泌某些血管生长因子刺激肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞和内皮细胞的相互作用自始至终贯穿于肿瘤血管生成的全过程。

    近年来研究显示,肿瘤来源的内皮细胞相对于正常内皮细胞具有增强血管生成活性,同时可以抵抗细胞生成抑制因子的特性。另外有文献报道,人类乳腺癌MDA-MB231 细胞所制备的肿瘤条件培养基(tumor conditioned medium, TCM) 中的白细胞介素-8 (interleukin-8, IL-8) 可以促进人类的间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) 的迁移。同时这种TCM 也可以促进脂肪组织来源的干细胞的迁移。

    肿瘤外渗过程中对内皮细胞的增殖、黏附、迁移特性有何影响至今尚无研究报道。本研究采用TCM 模拟体内肿瘤外渗微环境,进而观察肿瘤细胞外渗过程中内皮细胞一系列特性的变化情况,以期为抗肿瘤药物的开发提供新思路和作用靶标。

 

主要试剂

RPMI1640McCoy’s 5a、肝素、纤粘连蛋白(fibronectin, Fn)、胰酶、MTT 均购自Sigma 公司,胎牛血清为Gibco 产品,内皮细胞生长添加剂ECGS 购自美国Upstate 公司。

 

实验步骤:

(1)、细胞培养 

    人结肠癌细胞株HT29 购自ATCC,培养基使用含10% 胎牛血清、100 μg/mL青链霉素、1.5 mmol/L 谷氨酰胺和2.2 g/L 碳酸氢钠的McCoy’s 5a 培养基。人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) 购自ATCC,培养在含10% 胎牛血清、100 μg/mL 青链霉素、2mmol/L L- 谷氨酰胺、1.5 g/L 碳酸氢钠、0.1 mg/mL肝素和0.03 mg/mL ECGS RPMI1640 培养液中。上述细胞生长在37 ℃恒温、含5% CO2 的细胞培养箱内。生长至融合后用0.25% 胰酶-0.02% EDTA消化传代。

 

(2)TCM 的制备

    消化、接种HT29 细胞于孔板中,接种密度为105 孔。24 h 后移除培养基,用PBS 轻柔洗次,而后加入无血清的McCoy’s  5a 培养基。继续孵育24 h 后收集培养基,1 300 r/min 离心5 min,取上清。20 ℃保存待用。

 

(3)、内皮细胞增殖能力的测定

    取对数生长期的HUVEC 消化成单细胞悬液后接种于96 孔板,2.5 × 105个细胞/孔;实验设对照组、TCM原液(TCM stock solution) 处理组、TCM 一倍稀释液(TCM monodilution) 处理组以及TCM 二倍稀释液(TCM didilution) 处理组,每组设个复孔。继续培养过夜后,移除培养基,用PBS 轻柔洗两次,而后用三种浓度的TCM 和无血清McCoy’s 5a 培养基分别作用于各组细胞,37 ℃孵育24 h 后,采用MTT 法检测细胞增殖程度。于全自动酶标仪570 nm 处测定吸光度值,参比波长630 nm,以吸光度值表示内皮细胞增殖程度。

 

(4)、内皮细胞黏附能力的测定

    用10 μg/mLFn 预铺96 孔板,70 μL/ 孔,℃过夜后,PBS遍, 而后用1% BSA/PBS 37 ℃ 封闭1 hPBS 遍。内皮细胞分别用TCM 原液和无血清McCoy’s 5a 培养基处理24 h 后消化成单细胞悬液,分别接种于预铺Fn 96 孔板中,每组设个复孔。37 ℃孵育1 h 后,PBS 洗去未黏附的细胞,5% 戊二醛于℃固定0.5 hPBS 遍;0.1% 的结晶紫染色, 室温0.5 hPBS 遍;每孔加入100μL 10% 的乙酸,5~10 min 后用全自动酶标仪检测595 nm 处的吸光度值,用以表示黏附细胞的多少,间接反映不同细胞的黏附能力差异。

 

(5)、内皮细胞迁移能力的测定

    采用划痕法测定内皮细胞迁移能力。96 孔板用70 μL 10 μg/mLFn 预包被,℃过夜后,用PBS 遍。将内皮细胞接种于已包被的96 孔板,细胞长至融合后,用无菌200 μL 的移液器吸头划痕,造成细胞间的刮沟,用PBS 冲洗后,分别用TCM 原液和无血清McCoy’s 5a 培养基作用于处理组和对照组细胞,每组设个复孔。37 ℃孵育12 h24 h 后用倒置相差显微镜观察、拍照,每条划痕随机取处用共聚焦软件测量划痕距离。以划痕宽度变化表示细胞迁移能力的大小,划痕宽度变化愈大,则表示细胞迁移能力愈强。具体方法为:于0 h12 h24 h 分别测定各组细胞划痕宽度,并计算其迁移距离,迁移距离=0 h 时的划痕宽度 各时间点的划痕宽度。

 

(6)、数据统计处理 

各组数据以mean ± SD 表示,用方差分析或检验进行显著性分析,以P < 0.05为差异具有统计学显著意义。

 

五、 动物实验

1、裸鼠成瘤实验检测成瘤能力

    裸鼠成瘤模型是在研究肿瘤生物效应和抗肿瘤实验治疗的重要工具,具有稳定和简便易行的特点。皮下接种的肿瘤细胞一般呈球形生长,有完整的包膜,且不易发生远处转移。裸小鼠先天性无胸腺,仅有胸腺残迹或异常的胸腺上皮,这种上皮不能使T细胞正常分化,不能执行正常T细胞功能。由于缺乏成熟T细胞的辅助、抑制及杀伤功能,细胞免疫力低下,使得异种移植成为可能,但同时也使我们无法观察到肿瘤细胞在机体完整免疫功能状态下的生长和被抑制情况。因此我们仍有必要进一步探讨与人体正常生理功能更加接近的动物模型。

 

实验步骤:

(1)、取5-6周龄裸鼠饲养(此时大小约16-23 g)。虽然此时的裸鼠个头较小,但是,标准的做法与权威的文章都是如此。考虑可能是此时裸鼠个体差异小,对实验数据影响小吧。
(2)、制备肿瘤细胞悬液,按5×106-2×107细胞/只(稀释成0.2ml)接种于裸鼠腹腔,形成腹腔种植瘤。(小鼠腹水出现情况一般如下:5~6 d出现腹水,6~8d抽取传代最好,10~12 d出现血性腹水,14~15 d小鼠开始死亡。)
(3)、取腹水瘤,细胞数5×106-2×107,稀释成0.2ml接种于裸鼠前腋皮下。
(4)、加药。根据使用药物的不同,方法各异。时间上可以是24小时,或第1、3、5天等等。给药方式可以是腹腔或鼠尾静脉。注意,由于鼠尾静脉非常细,推药一定要非常慢。药物的量一般根据裸鼠的体重进行调节。当然,最重要的是药物的特性。
(4)、20-30天处死裸鼠,并进行相关数据的检测(肿瘤大小、重量等。)。注意时间点,可以经常观察,在最能体现你结果的时候将裸鼠处死。

2、小动物活体成像实验(需要荧光标记)

小动物活体成像主要采用生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP, Cyt及dyes等)进行标记。利用一套非常灵敏的光学检测仪器,让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统,可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下,可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录,跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)的移动及变化,所得的数据更加真实可信。另外, 这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高,不涉及放射性物质和方法, 非常安全。因操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内,已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等面。

 

 

3、血液/组织液中LDH 检测

    乳酸脱氢酶LDH在所有的器官和组织中都大量存在(包括红细胞)。它存在于细胞浆中,在细胞膜受损和细胞坏死时,便释放入血流中。因此,其升高是非特异性的。

    活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下,LDH不能透过细胞膜,当细胞受到NK细胞的杀伤后,LDH释放到细胞外。LDH 可使乳酸锂脱氢,进而使NAD还原成NADH,后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化四氮唑(INT),INT 接受H+被还原成紫红色甲月赞类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。

 
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