汉恒高滴度逆转录病毒

 

汉恒高滴度逆转录病毒

 

 

                     髓系细胞:K562   U937   THP-1   L1210   HL-60 ……

淋系细胞: A3  Supb15   Reh  Jurkat …… 

NK系:NK92 

             原代细胞:造血干(LSK) 原代T,B,NK,PBMC 


         你还在为转染这些细胞而苦恼吗?
       汉恒高滴度逆转录病毒轻松搞定!
     

 

 

汉恒生物现推出逆转录病毒试用装申请免费活动

 

试用装规格

 

【限量100份(GFP),体积50ul  】

【滴度不低于1x10的8次方TU/ml 】

 

汉恒还可根据客户具体需求给出特定的逆转录试用装。

 

 

 

一、逆转录病毒试用装的分装与贮存

 

 

1.收到汉恒生物逆转录病毒产品后,请先对逆转录病毒产品进行分装处理,建议20-50μl/管。如1-2天内使用,则留足够量病毒4℃保存,余下逆转录病毒置于-80℃长期保存。

2.病毒可以存放于-80℃ 6个月以上;但如果病毒储存时间超过 6个月,建议在使用前重新测定病毒滴度。

3.反复冻融会降低逆转录病毒滴度:逆转录病毒滴度越低,冻融对滴度的影响越大,108 TU/ml的逆转录病毒冻融2次滴度没有显著性差异,第3次冻融开始,每冻融一次滴度降低约10%。

 

 

 

二、逆转录病毒试用装的实验策略与关键知识点

 

1.逆转录病毒感染策略

 

逆转录病毒本身的病毒滴度不高,感染细胞时病毒消耗量较大,试用装体积较小,建议使用96孔板进行MOI梯度感染测试。逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转,因此逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞,然后将细胞放大化培养。而不是直接大量感染。

注意:对于一些传代能力较差的原代细胞,比如BMSC等,建议采用腺病毒感染。

 

2.逆转录病毒感染关键知识点

 

1)细胞准备:由于试用装体积有限,请使用96孔板准备细胞,逆转录病毒感染细胞前,请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%~60%间为宜。

2)感染细胞最佳MOI的测定:MOI(感染复数)是指每个细胞感染的病毒数。

      逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞,其最适MOI各有差别,原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。MOI一般以3,10,30,100的比例递增进行梯度摸索,一般的细胞基础逆转录病毒感染MOI可从3为开始,即设立4个常规的MOI摸索,即3,10,30,100。

3) 助转剂polybrene的选择:实验证明,polybrene可提高逆转录病毒对大部分细胞的感染效率,但polybrene有一定的细胞毒性,不同细胞对polybrene的敏感度不同,polybrene最常用的工作浓度为5~8μg/ml。

4)MOI对应病毒体积的换算(非常重要)

感染时细胞数(一般以传代计数细胞数×2计算)×MOI=病毒个数;则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。

 

三、逆转录病毒感染细胞步骤:(1/2小体积感染法)

 

1.感染前准备

1)按实验需要将细胞铺96孔板,37℃ 培养过夜。细胞数以第2天密度约40%~60%间为宜。

2)从冰箱取出逆转录病毒并在冰上缓慢融化,待完全融化后开始病毒感染实验。

 

2. 目的细胞的感染(1/2体积4小时感染法)

1) 吸去细胞原有培养基,加入1/2体积新鲜培养基,并往新鲜培养基里加入终浓度5~8μg/ml的polybrene(部分polybrene不耐受细胞除外),再根据选定的MOI值,换算对应的病毒原液体积,并按体积将病毒原液加入细胞中,摇匀。

1/2体积4小时病毒感染体积

培养皿类型

表面积/cm2

1倍细胞培养基体积

1/2培养基体积

96-well

0.3cm2

100μl

50μl

24-well

2cm2

500μl

250μl

 

2)针对贴壁细胞,细胞中加入病毒液后直接置于37℃培养箱感染4小时。

3)若目的细胞是悬浮或半悬浮细胞,则需要通过平角离心转染法进一步促进病毒对细胞的感染性吸附,即将适量的病毒液加入细胞培养板后,封好口,放入平角离心机后,低速(300g)离心1h,然后放入37℃培养箱中继续积感染3小时。

4)37℃培养箱中感染完毕后,取出细胞,直接往含病毒的培养基中加入另外1/2体积新鲜培养基(含终浓度5~8 μg/ml的polybrene,部分polybrene不耐受细胞除外)。

5)感染后第二天(约12-16小时),吸去含病毒的培养液,换上新鲜的完全培养液(不含polybrene),继续37℃培养。

6)感染72小时后,荧光显微镜检测GFP等荧光表达效率,确定最适MOI。

7)稳转株的初筛选:如病毒载体携带puromycin抗性,感染72小时后置换含适当浓度的puromycin(1~3 μg/ml)的新鲜完全培养液,同时准备一组普通目的细胞(简称Blank组,其细胞数量、密度和病毒感染组细胞一致),加入等终浓度的puromycin。每2-3天换含puromycin的完全培养液一次,直到Blank组细胞被puromycin杀光。

 8)稳转株的二次筛选与培养放大:将puromycin终浓度减半(简称:1/2 puro培养基)培养存活的病毒感染组的细胞(包括目的基因和对照病毒组),并在细胞长密到80%左右进行细胞传代,传代后的细胞为P2代稳转株,P2代-P4代继续用1/2 puro培养基培养细胞,大量扩增细胞至4代,并大量冻存P4代的稳转细胞株,以备后续实验。

 

(1)逆转录病毒感染图片

(2)逆转录病毒感染荧光图片

 

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