Puromycin 嘌呤霉素盐酸盐

 

产品名称

货号

规格

价格

Puromycin 嘌呤霉素盐酸盐

HB-PU-500

500 μl

550

Puromycin 嘌呤霉素盐酸盐

HB-PU-1000

  1 ml

680

产品描述

嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌,各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物,能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后,不会参与随后的任何反应,从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

       嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC),赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。

  嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关,现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下,嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。

 

产品性质

CAS号(CAS NO.

58-58-2

分子式(Formula

C22H29N7O5·2HCl

分子量(Molecular weight

544.43

纯度(Purity, HPLC

98%

外观(Appearance

白色至米白色粉末

结构式(Structure

 

运输和保存方法

冰袋运输。

4℃干燥保存,1年有效;为了维持最好的产品稳定性,建议-20℃干燥保存,2年有效。

 使用方法

1.        建议使用浓度

哺乳动物细胞:2 μg/mL最佳浓度需要杀灭曲线来确定;

大肠杆菌:LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌,使用浓度为125μg/mL注:使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节,而且受宿主细胞本身的影响。

2.        溶解方法

用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液,经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存;也可溶于甲醇,配制成10 mg/ml的储存液。

3.        嘌呤霉素杀灭曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒转导为例)

嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株,确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线(kill curve)。

1 Day 124孔板内5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜;

2 Day 2a)准备筛选培养基:含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度);b)往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培养基;之后37℃孵育细胞;

3 Day 4:更换新鲜的筛选培养基,并观察细胞存活率。

4 根据细胞的生长状态,约2-3天更换新鲜的筛选培养基;

5 每日监测细胞,观察存活细胞率,从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非转导细胞的药物最低浓度。

4.        哺乳动物稳定转染细胞株的筛选

等转染含有pac基因的质粒后,细胞在含有嘌呤霉素的培养基中增殖,以筛选出稳定转染子。

1)   细胞转染48h后,将细胞(原样或稀释)置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养。

注意:当细胞处于分裂活跃期时,抗生素作用最明显。细胞过于密集,抗生素产生的效力会明显下降。最好进行细胞分盘使其密度不超过25%

2)   每隔2-3天,移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。

3)   筛选7天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间,这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。注意:每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要48h,有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。

4)   转移和放置5-10个抗性克隆到一个35mm的培养皿中,用选择培养基继续培养7天。此次富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。

注意事项

1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2)嘌呤霉素为有毒化合物,操作时请小心拿放。

 
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