circBasic 环状RNA克隆构建试剂盒

circBasicTM 环状RNA克隆构建试剂盒使用说明

 

产品货号信息:

 

产品货号

产品规格

HB-circ-10

10 Tests

HB-circ-20

20 Tests

储存信息:-20°C 保存一年有效.

 

产品内容: 

产品内容

体积(10 tests)

体积(20 tests)

Linearized pHB-circBasicTM plasmid

(50 ng/ml)

15 ml

25 ml

 HB-infusionTM Master Mix (2x)

150 ml

250 ml

Positive circRNA (circPC) template ( 20 ng/ml)

25ml

25 ml

 

 

 

 

 

本试剂盒用到的引物如下(试剂盒没有配备,需要自行合成):

Primer

Sequence (5’-3’)

Notes

pHB-circBasic_F

gtaagaagcaaggaaaagaattaggctcg

pHB-circBasicTM线性化引物

pHB-circBasic_R

ctgaagtataaaaaaaaagtcattagtacgtacctttacaaaaag

Construction ID_F

CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

重组子鉴

定引物

Construction ID_R

GTGTGAGCTACCGTGCCG

T7_F

taatacgactcactataggg

克隆测序引物

BGH_R

tagaaggcacagtcgagg

circPC_F

cgtactaatgactttttttttatacttcagGTTCATCATGCCTAGTGGCATATAAGAAGAC

circPC扩增引物

circPC_R

cctaattcttttccttgcttcttacCTTCTTCAGAGAGGTTGTTCTCTTTGGT

circPC_ID_F

CTCACAGCATGTCCTCCCG

阳性circRNA成环鉴定引物

circPC_ID_R

GTCCAGGCTGTCTGATGAG

 

                    

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

   

图1 pHB-circBasicTM载体和线性化位点示意图

 

汉恒生物pHB-circBasicTM是一个5.5kb大小的环状 RNA (circRNA) 非病毒过表达载体。该载体可用来转染哺乳动物细胞,可高效表达circRNA并促使其高效成环。该载体具有以下特点:

1)人巨细胞病毒的CMV启动子可以高效表达目的circRNA。

2)上下游成环元件Front cir-signal和Back cir-signal可以高效促使表达的circRNA环化。

3)线性化的载体非常方便目的circRNA直接无缝克隆,极大降低无关序列参与成环的几率。

 

实验流程

一、 circRNA载体构建步骤:

基于pHB-circBasicTM的circRNA过表达构建采用无缝克隆策略。该策略促使成环的circRNA序列和天然的circRNA一致,其做法是利用汉恒HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒,将目的circRNA序列拼接到线性化载体上即可(如图2)。

 

图2 汉恒HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒构建circRNA过表达示意图。

 

克隆基本信息如下:

1) 目的circRNA扩增。扩增引物如下:

circ_F: cgtactaatgactttttttttatacttcag+circRNA特异性正向扩增引物 (18~25bp,需要自己设计添加)

circ_R: cctaattcttttccttgcttcttac+circRNA特异性反向扩增引物(18~25bp,需要自己设计添加)

目的cirRNA扩增引物由两部分组成:引物5’端的下划线部分+目的cirRNA特异性扩增引物。其中下划线部分为无缝克隆所必需,目的cirRNA特异性扩增引物和普通RT-PCR扩增引物设计类似。这对引物是以目的circRNA的cDNA或者人工合成DNA模板为模板(推荐人工合成)进行PCR扩增。PCR程序如下:

 

 

 

产物需跑胶纯化、定量待用(操作细节请参考“HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒使用说明”)。

2) 无缝克隆拼接circRNA和线性化pHB-circBasicTM载体

待HB-infusionTM Master Mix充分融化混匀,按如下体系加入各反应组分:

 

 

 

50℃孵育25 min,转化DH5a感受态。

3) 重组子鉴定:

克隆鉴定引物如下:

Construction ID_F: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

Construction ID_R: GTGTGAGCTACCGTGCCG

 PCR程序如下:

 

 

 

空载体PCR产物大小~280 bp;重组子PCR大小约为280 bp+circRNA大小。

4) 测序验证

使用pcDNA3.1通用正反向测序引物对重组子进行测序鉴定。

T7_F:taatacgactcactataggg

BGH_R:tagaaggcacagtcgagg

5) 转染成环验证

通常转染到293T细胞验证能否成环。验证方法是设计circRNA对应的divergent primer进行RT-PCR并测序。

6) 转染目的细胞分析表型和功能。

如果目的细胞转染效率较高则可以直接转染做功能分析。否则建议使用汉恒生物的病毒载体系统circEnhancedTM提高感染效率。

 

二、 构建实例

我们以一个阳性circRNA (circPC)构建实例来说明这一载体具体使用方法:

1. 已知circPC的序列如下:

GTTCATCATGCCTAGTGGCATATAAGAAGACCCCACCACCGGTCCCTCCACGAACCACATCGAAACCGTTCATCTCAGTCACCGTCCAGAGCAG

TACTGAGTCTGCTCAGGATACCTACCTGGACAGTCAAGACCACAAGAGCGAAGTGACGAGCCAGTCGGGCTTGAGCAACTCATCAGACAGCCTG

GACAGCAGTACCCGGCCACCCAGTGTGACACGGGGTGGAATTACCCCAGGCCCTGAAGCTCCGGAGCCACCCCCTAAGCATGCAGCTCTGAAGA

GTGAACAAGGGACACTGACGAGCTCTGAGTCCCATTCCGAGGCCATCCCCAAAAGGAAACTGTCATCGATAGGAATACAAGTTGACTGCATTCAG

CCAGTGCCAAAAGAGGAGCCCAGTCCCGCTACCAAATTCCAGTCCATCGGGATTCAGGTAGAGGACGACTGGCGAAGCAGTGCCCCCTCTCACAGC

ATGTCCTCCCGTCGGGACACTGACTCTGATACCCAGGATGCCAACGACTCCAGTTGTAAGTCATCTGAGAGGAGTCTCCCAGACTGTACCTCACAC

CCCAATTCCATCAGCATTGATGCTGGCCCCCGACAGGCCCCCAAGATTGCCCAGATCAAGCGCAACCTCTCCTATGGAGACAACAGCGACCCTGCC

CTGGAGGCGTCTTCGCTGCCCCCACCCGACCCTTGGCTGGAGACTTCCTCCAGCTCCCCAGCAGAGCCCGCTCAGCCAGGGGCCTGCCGCAGGGAT

GGCTACTGGTTCCTGAAGCTCCTTCAGGCAGAAACGGAGAGACTGGAAGGCTGGTGCTGCCAGATGGACAAGGAGACCAAAGAGAACAACCTCTC

TGAAGAAG

注:circRNA序列可以通过ID或者序列从circBase调取,教程可以联系汉恒技术工程师索取。

2. circPC的扩增:

1) circPC扩增引物:

circPC_F: (61bp,TM=60°C)

cgtactaatgactttttttttatacttcagGTTCATCATGCCTAGTGGCATATAAGAAGAC

circPC_R: (53bp,TM=60°C)

cctaattcttttccttgcttcttacCTTCTTCAGAGAGGTTGTTCTCTTTGGT

2) circPC扩增程序:

 

 

3) 无缝克隆拼接circPC和线性化pHB-circBasic载体,体系如下:

 

 

 

50℃孵育25 min,转化DH5a感受态。

4) 重组子菌落PCR鉴定:

克隆鉴定引物如下:

Construction ID_F: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

Construction ID_R: GTGTGAGCTACCGTGCCG

PCR程序如下:

 

1%琼脂糖凝胶电泳确定阳性:空载体PCR产物大小~280 bp;阳性重组子PCR大小约为1.1 kb。

5) 阳性重组子测序

使用pcDNA3.1通用正反向测序引物对重组子进行测序鉴定:

T7_F:taatacgactcactataggg

BGH_R:tagaaggcacagtcgagg

6) 转染293T细胞,确认成环。

如果转染效率足够,也可以在目的细胞内验证成环。利用divergent primer通过RT-PCR来鉴定过表达circRNA是否成环,其引物信息如下:

circPC_ID_F: CTCACAGCATGTCCTCCCG

circPC_ID_R: GTCCAGGCTGTCTGATGAG

产物大小:590 bp.

PCR体系如下:

 

 

 

PCR 程序如下:

 

 

 

7) 如果条带大小符合预期则通过测序确认接头序列,测序引物:

circPC_ID_F: CTCACAGCATGTCCTCCCG.结果峰图如下,发现circPC首尾相连证明成功成环

 

 

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