western blot检测

 

 

 

 

蛋白印迹 (Western Blot) 是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法,用于检测经电泳或斑点杂交后固定于膜上的蛋白质。特异、稳定的液态酶标抗体和相应底物,保证了快速、准确的检测,并且避免了放射性物质的使用。现已成为蛋白分析的一种常规技术,对蛋白进行定性和半定量分析。

 

Western blot技术的一般步骤是将经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。由于Western blot检测技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点,因此可检测到1-5 ng (最低可到10-100 pg)中等大小的靶蛋白。同时,Western blot技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

 

 

 

 

技术优势

 

(1)高效蛋白提取液进行高质量蛋白的提取,同时高效的蛋白酶抑制剂有效防止蛋白的降解及去磷酸化等作用;

 

(2)汉恒生物拥有多年的Western Blot检测经验,为客户提供专业的技术服务。

 

(3)汉恒生物为客户设置预实验,根据客户样品具体情况摸索最适上样量和抗体最适稀释度。

 

 

样品要求

 

客户提供新鲜或正确保存的蛋白样品或者蛋白提液,阳性对照样品(细胞或组织), 检测目的蛋白的一抗(或由汉恒生物代购)。样品要求为:

 

1、细胞不少于5×106个;

 

2、组织样品不少于50mg;

 

3、总蛋白浓度不低于 2μg/μl(至少50μl)。

 

 

 

实验内容

 

 

1蛋白提取和定量(如果提供蛋白样品,则直接电泳预实验检测抗体特异性);


2SDS-PAGE 10-15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;


3转膜(PVDF膜);


4封闭(5%脱脂奶粉);


5一抗孵育(其中内参基因为Tubulin、GAPDH或Actin);


6二抗孵育(如果由于材料降解或一抗造成实验无法继续,则收取相关预实验费用);


7显色(ECL);


8曝光、洗片、分析

 

 

 

提供产品内容

 

 

蛋白浓度,扫描图,以及灰度分析(如果需要)及完整实验报告

 

 

 

注意事项

 

 

每张膜上做一种目的蛋白和相应的内参蛋白。每张膜上可以做8个样品一般状况下,2周即可完成实验。如遇特殊情况,如一抗不好,蛋白浓度低或蛋白特殊,如分子量大等,周期会有所延长。

 

 

 

 

Western Blot细胞蛋白样本的准备及运输

 

 

去掉培养液,用PBS洗一次后,加入少量PBS,用细胞刮将细胞刮下,用1ml枪吸取细胞易于1.5ml EP管中,快速离心(升至最高转速就可stop)去除上清后,可按下面两种方法运输:

 

1、细胞干运输:将细胞干放入液氮速冻,-80℃保存如需长途过夜运输,建议干冰运输;如当天送达样本,可用液氮或者-80冰袋运输。

 

2、细胞裂解液运输:加入一定量的胞裂解液后即可冷藏运输(冰袋或者冰盒)。如需检测磷酸化蛋白,建议裂解液中加入终浓度1mMNaFNaF可抑制磷酸酶活性,保护蛋白磷酸化水平。如果加入裂解液后提取蛋白,则置于冰上裂解1 h12000rpm离心10 min后取上清,即为蛋白样本。蛋白样本可-20度冷藏运输(建议快递寄送用干冰或者足量-80度冰袋),保存需要-80℃。

 

3、蛋白样本运输

注意:蛋白样本需要经过浓度测定,再进行变性,变性时先加入Sample buffer,再95℃ 10 minSample buffer可防止变性导致的蛋白沉淀析出。变性的蛋白可直接冷藏运输,-20℃稳定保存。

 

 

 

Western Blot实验服务结果实例图

 

 

 

 

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