microRNA表达检测

 

简介

 

MicroRNAs(miRNAs)是一种小的内源性非编码RNA分子,大约由21-25个核苷酸组成。这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA,通过翻译水平的抑制或直接降解靶标mRNAs而调节基因的表达。

 

miRNAs起源于内源性表达转录本,广泛存在于线虫、果蝇、植物、哺乳动物等众多生物体中。

 

miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA(PrimarymiRNA)转录本;这个70-100nt的发卡RNAs(pri-miRNA)在核内被核糖核酸酶Drosha加工处理而最终成为pre-miRNA(Precursor miRNA);之后pre-miRNA被核输出蛋白exportin 5转运入胞质,接着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21-25nt的miRNA;这个阶段的miRNA可以结合RISC(RNA-Induced Silencing Complex)并与靶标mRNA互补并列;miRNA和靶序列的互补程度决定了靶基因mRNA在翻译水平被部分抑制或被直接降解。

 

植物体中,促进靶mRNA降解是主要的工作方式,而哺乳动物中则以翻译水平的抑制为主要方式。

 

 

microRNA的表达检测

 

由于miRNAs在众多程序的调控,诸如发育、细胞增殖和凋亡以及肿瘤发生相关等领域发挥作用,因此miRNAs的鉴定和定量研究成为迅速发展的研究领域。miRNA的发现可以通过克隆特定组织、细胞或者某个生物体特定发育阶段的miRNA并测序完成。microRNA芯片或qPCR的检测方法比较简单,可以快速的对定量已知的miRNA表达差异。

 

1、microRNA 芯片服务

 

Agilent Technologies Inc.开发出具有独特设计的miRNA检测芯片,能特异性地检测出成熟的miRNA并能很好地区分高度同源的miRNA 分子。该平台还具有特异性高、灵敏度高等特点。可以广泛地应用于检测和比较各类样品的miRNA表达状态,并通过分析其调控的靶基因来深入分析其调控机制或生物学功能。

 

作为miRNA芯片的后起之秀,Agilent miRNA芯片自上市之初就受到业界广泛关注,上市两年来,其优异的性能指标更是获得科研工作者的广泛认可,2009年稳占国内市场应用第一名。

 

                                                     

 

Agilent microRNA芯片技术特点:


1. 唯一能通过特殊的探针设计区分成熟miRNA和miRNA前体的芯片平台;


2. 无需分离miRNA,直接用Total RNA 进行实验,只需100ng的Total RNA 即可用来进行标记实验,避免了分离、富集、放大等过程带来的影响; 


3. 样品适用范围广:组织、血清、血浆、FFPE、冰冻切片组织、脱落细胞等均可进行实验;


4. 高特异性:特殊的专利探针设计能区别一个碱基的差异; 


5. 高灵敏度:检测丰度跨4个log,最高可达6个log,只要存在6000个拷贝的分子就可以检出。

 

 

2、qPCR检测microRNA的表达

 

对于检测较少几种miRNA的表达差异通常采用Real-Time PCR的来对miRNA进行检测,其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。

 

工作原理 :


茎凸环结构的逆转录引物能与miRNA 3'端部分结合,在逆转录酶的作用下进行逆转录反应,然后特异的正反向引物和SYBR Green荧光染料共同参与的定量PCR反应体系,实现对逆转录产物进行定量检测。

 

 

检测优点:

 

  • 检测简便、快捷、节约:miRNA qPCR Detection System是基于SYBR Green染料法的qPCR检测系统,可用于从一个合成反应的cDNA中检测多种miRNAs。

 

  • 检测的特异性:独特的miRNA引物设计技术及其优化的反应体系避免了转染质粒的污染 

 

  • 检测分辨率高:该系统能分辨单碱基差异的miRNA。 

 

  • 检测灵敏度高:可在低至pg级的总RNA中检测到特异表达的miRNA。

 

 

 

 
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