细胞迁移、侵袭及划痕

 

一、划痕实验

 

胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法,实验成本低,可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。

 

实验内容:

材料:6 孔板(其他多孔板亦可,但6孔较好,大小适中)、marker笔、直尺、20微升枪头(灭菌)、无血清培养基、PBS

步骤:所有操作器械都要提前灭菌,直尺和marker笔在操作前用紫外照射30min(超净台内)


1.先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀地划横线,大约每隔0.5~1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。


2.在孔中加入约5X105个细胞,具体数量因细胞大小及特性的不同来设定,掌握为过夜能铺满孔板为宜。


3.第二天用枪头比着直尺进行划痕,直尺尽量垂直于背后的横线,枪头要垂直,不能倾斜。


4.用PBS洗3次,去除划落的细胞,然后加入无血清培养基。


5.放入37度5% CO2培养箱中进行培养。之后按0,6,12,24小时取样,拍照。

 

注意事项:


1. 一般做划痕实验,都是在无血清或者低血清状态下培养的,否则细胞本身的增殖情况就不能忽略。

 

2. 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕,可以形成若干交叉点,作为固定的检测点,这就解决了前后观察时位置不固定的问题。

 

 

二、Transwell检测迁移

 

细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

 

实验步骤:

 

1. 材料准备:


可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)

 

2. 步骤和流程:


2.1基质胶铺板:


用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。


2.2制备细胞悬液

 

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。


②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。


2.3接种细胞


①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。


②24孔板下室一般加入600µl含20%PBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。


③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。


2.4结果统计


直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。


1. 取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。


2. 0 .1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。


3. 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。

 

 

 

三、 Transwell检测侵袭

 

transwell侵袭实验就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开,细胞放在低营养的培养液里,细胞会往高营养的培养液方向移动。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

 

实验内容:

 

(1)共培养体系:


小于3.0um孔径条件下,细胞不会迁徙通过,因此,若研究不涉及细胞运动能力,不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。


(2)趋化性实验


 可用5.0、8.0、12.0µm膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
 ①细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
 ②趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。


(3)肿瘤细胞迁移实验


 常用8.0、12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。


(4)肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0µm膜,原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

 

在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶,模仿细胞外基质,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或实验设定的药物或者影响因子,细胞会分泌相关酶类消化模拟细胞外基质膜的基质胶,从而从上室迁移到下室,通过计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。

 

实验图片示例:

 

 

 
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