原代 T 细胞分离培养及病毒感染操作

 

汉恒生物独家研发适用于原代T细胞的病毒有两种:逆转录病毒(mTRv和hRv)和悬浮细胞专用的腺病毒(Ads)。其中逆转录病毒感染细胞具有物种特异性,适用小鼠原代T细胞的为mTRv,适用人原代T细胞的为hTRv。逆转录病毒可以用来构建稳转系。专用腺病毒Ads不区分物种,对人、小鼠等物种的原代T细胞均具有很高的感染效率,另外,Ads也非常适用感染其他悬浮细胞,如Jurkat,K562,HL-60和L1210等,Ads专用腺病毒不适合用来构建稳转系,详情请参考汉恒悬浮细胞专用腺病毒操作技术文档”。

. 小鼠脾脏细胞悬液制备

1. 脱颈处死小鼠,腹部朝上正体位暴露小鼠右侧腹部。

2. 75%乙醇消毒,剪开腹部切取脾脏。

3. 将脾脏放入预先放置好cell strainer(FALCON,352350)并已加入5ml 无菌PBS的六孔板或培养皿中。

4. 用无菌注射器柄充分研磨脾脏。

5. 弃掉cell strainer,轻柔吹打细胞至充分重悬,收集到一无菌15 ml离心管中,于4℃ 400g,离心5 min。

 注:一旦取出脾脏,请置于冰上操作。

6. 将第5步离心后弃上清的脾脏细胞用5 ml无菌ACK裂解液轻柔充分吹打混匀,于冰上裂解5 min。

    注:ACK裂解液配方如下表,配好之后用0.22 μm的滤膜过滤,4℃保存不超过1月

 

 


7. 裂解结束后加入10 ml无菌PBS终止裂解反应,于4℃ 400g离心5 min。

8. 弃上清,用10 ml无菌PBS洗一次,弃上清后直接加入培养基重悬计数,一只脾脏可得3-10´107个细胞。

    注:如果要进行下一步的分离CD4+T细胞操作,请直接按照说明书将细胞重悬在合适体积的PBS中。

 

. 人PBMC细胞制备

1. 取一15 ml离心管,加入2 ml已用抗凝剂处理过的人血液样品,再加入等体积的PBS进行稀释(终体积4 ml)。

    注:若为经过处理的浓缩血液样品,请按照新的稀释倍数合理稀释。为了保证分离细胞的活力和效率,

       请使用新鲜血液,血液样品请于18-20℃保存。

2. 上下颠倒或用枪混匀样品,备用。

3. 上下翻转确保Ficoll-Paque PLUS (GE)分离液彻底混匀,去掉聚丙烯瓶盖,使用注射器针头插入瓶塞吸取3 ml分离液。

    注:分离之前请将Ficoll-Paque PLUS分离液预热至18-20℃。

4. 取一新的无菌15 ml离心管,加入3 ml 步骤3中取出的分离液。

5. 小心加入稀释好的4 ml血液样品,不要打破Ficoll-Paque PLUS液面。

    注:可将离心管倾斜至与水平台面呈30°,缓慢沿管壁加入血液样品。

4.将离心管小心竖直放入离心机内,于18-20℃,400g离心30-40 min。

注:特别注意将离心机的降速加速度调到0。

6. 小心取出离心管。此时液体分为3层,中层为分离液层,最下层为红细胞,最上层为血浆。位于中层靠近血浆层的白膜层即为单个核细胞层,小心吸走血浆层,不要打动白膜层。

    注:可吸出最上层的血浆层保存以备后续使用。

7. 用无菌移液枪将白膜吸到一新的离心管中。

8. 用三倍体积(约6 ml)的无菌PBS重悬步骤7中的PBMC,重悬时用枪轻柔吹散,于18-20℃,400g离心10-15 min,重复一次,最后用培养基重悬备用,多余的PBMC可以冻存继续使用。

    特注:在较高的离心速度下(400-500g)可以提高PBMC的得率,同时需注意在较低的离心速度下(60-100g)可以分离掉不需要的血小板。另外如上操作和比例适用于更大体积的分离。

 

. CD4+ T 细胞体外刺激

1. 按照小鼠或人源CD4+ T 细胞分离kit (Thermo) 说明书分离得到CD4+ T 细胞。

2. 取所需体积的PBS,按照5 mg/ml的终浓度加入Anti-mouse CD3e和Anti-mouse CD28抗体,500 μl/孔包被 Non-Treated 24-well plate,室温放置4h,吸掉抗体悬液,加入500 μl 1% BSA(PBS配置)室温封闭30 min,     封闭结束加入500 μl PBS洗孔一次。

    注:请在分离细胞的同时准备好平板,包括后续感染所需的量。

3.将分离得到的CD4+ T按照浓度5´105 cell/ml重悬在完全T细胞培养基中(1640, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 50 mM β-mercaptoethanol, 100 U/ml IL-2),将细胞加入步骤2中包被处理好的平板,2 ml每孔(1´106 cell/well),然后放入37℃ CO2培养箱刺激培养48h。细胞在刺激24h后体积略微增大,进入活化状态,刺激48h后可进行病毒感染。

 

四. CD4+ T细胞感染(以过表达GFP的病毒为例)

1. 收集活化好的CD4+ T细胞,400g离心5min。用T细胞培养基重悬计数备用,在收集的过程中发现有些细胞会贴壁,此为正常现象,可反复吹打至贴壁的细胞也呈悬浮状态。

2. 另取一Anti-mouse CD3e和Anti-mouse CD28抗体包被好的24孔板,每孔加入2-5´105的细胞(若为96孔板,加入2´104细胞/孔)。若考虑长期表达目的基因,按MOI=50-100加入汉恒生物T细胞专用逆转录病毒mTRv-GFP或者hTRv-GFP注意鼠源和人源原代T细胞所适合的逆转录病毒种类差别;若考虑瞬时(一周以内)表达目的基因,可按MOI=500-1000加入汉恒悬浮细胞专用腺病毒Ads-GFP。同时加入polybrene至终浓度6 mg/ml,最终感染体积为500 ml,加入病毒后轻轻吹打混匀。

注:具体MOI选择可在96孔板中预实验进行梯度摸索,对于逆转录病毒建议使用10,30,100的梯度进行,对于腺病毒建议使用500,1000,1500的梯度进行摸索。

3. 24-well plate于1000 g 室温离心感染90 min。离心结束后将平板放入37℃ CO2培养箱感染6 h。

    注:离心结束观察细胞分散状态,除非细胞全聚集在一处,否则不建议吹散细胞。

4. 感染结束后取出培养板,小心吸掉感染孔中350 ml的培养基(70%),加入1.85 ml的T细胞完全培养基补足体积为2 ml并吹打混匀。

5. 可选步骤:病毒感染24h后,小心吸掉培养基,在同一培养皿中按照2-4步进行病毒复感染操作。

6. 将细胞放入37℃ CO2培养箱继续培养,2-3天后可观察荧光,做流式检测感染效率。正常情况下,汉恒生物提供的T细胞专用逆转录病毒(mTRv和hTRv)和悬浮细胞专用腺病毒(Ads)感染原代T细胞的效率大于50%。

    注:感染后刺激的细胞增殖较快,请注意观察细胞密度并使其维持在1´106/ml左右。此外,如果需要让细胞增殖较长时间,为了防止其过度活化,可撤掉抗体的刺激。

原代T细胞病毒感染结果(见下)


  

 

 
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