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腺病毒感染目的细胞

因为不同细胞的MOI不同,所以在正式实验前,需设计预实验以确定目的细胞中加入的病毒数。

注:MOI: MOI multiplicity of infection的缩写,中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒颗粒所感染。不同实验室、不同操作手法及不同细胞系条件下所对应的细胞最佳MOI都是不同的,在正式实验之前强烈建议实验操作者进行一次摸索最佳MOI的预实验。

(一)细胞准备

将状态良好的目的细胞接种到24孔板,使细胞密度约为1×105/ml

注:接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同,一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%70%之间。

(二)病毒感染细胞(腺病毒感染细胞系的话可以略过纯化操作步骤)

感染之前,请按照梯度稀释病毒(附2),一般感染时MOI控制在3~1000区间范围。

1、感染贴壁细胞

感染实验分为两组,分别添加带目的基因的腺病毒和等滴度同体积的对照病毒,常用孔板参数如下表(简而言之,就是把一定体积的病毒直接加入到完全培养基中即可)。加入的病毒量范围在MOI=31000,一般设置MOI摸索梯度为310301003001000(详见附2)。每个MOI值加两个孔,4~8h后更换成新鲜完全培养基。

举例:假如收到的病毒滴度为5´1011PFU/ml, 首先用完全培养基稀释到5´1010PFU/ml110稀释)。现在要感染细胞数1´105/孔一个孔,MOI=1000,则需要5´1010PFU/ml病毒的体积=1´105´1000/5´1010 ml=2 ml。直接吸取2 ml5´1010PFU/ml病毒混入孔板的培养基中即可。混匀后继续培养4-8 hr后更换新鲜的完全培养基。48-72hr可以观察荧光、WB等实验。

注:遗弃的废液按照病毒废液来处理!

腺病毒小体积感染表

培养皿类型

表面积/cm2

培养基体积

腺病毒体积

96-well

0.3 cm2

100 µl

0.1-0.5 µl

24-well

2 cm2

500 µl

1-3 µl

12-well

4 cm2

1 ml

2-5 µl

6-well

10 cm2

2 ml

5-20 µl

2、感染悬浮细胞

感染悬浮或半悬浮细胞,则需要通过平角离心转染法,即将适量的病毒液加入细胞培养皿后,封好口,放入平角离心机后,低速(200×g)离心1 h,然后放入培养箱中正常培养即可。若实验条件有限,没有平角离心机,可用离心管代替,将细胞吹打吸入离心管中,进行低速离心,去掉大部分上清,然后加入适量的病毒液,室温放置15 min(不要超过30 min),然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续培养,感染过夜后换液即可。

(三)观察感染情况

感染48~72h后,可开始观察到GFP/RFP的表达;也可通过qPCRWB验证目的基因在基因水平和蛋白水平的表达情况。

Chinese, Simplified
 
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