如何研究自噬PART5:其他细胞器的自噬研究和自噬流荧光数据的处理

前期回顾

PART1:自噬的概念及自噬切入角度

PART2:自噬的“黄金标准” 及调控自噬流的方法

PART3:自噬领域的金牌研究工具

PART4:基因的操作在自噬研究过程的作用

 

 

PART5

其他细胞器的自噬研究

 

除此之外,我们还可以使用上面提到的pH敏感的荧光蛋白Keima来监测线粒体自噬。如图1,我们人为给Keima上添加一个线粒体定位信号,使之表的Keima主要定位在线粒体上(记为mito-Keima)。

 

因为线粒体及其自噬小体中的pH值偏中性,此时在440 nm附近会被激发出很强的荧光信号,而在550 nm被激发的荧光信号较弱,550/440二者比值较小;随着线粒体自噬的发生,自噬溶酶体的融合逐渐降低Keima周围的pH值(酸性),此时440 nm激发出的荧光信号减弱,而550 nm激发的荧光信号变强,550/440二者比值逐渐增加。

 

根据二者比值的大小可以判断线粒体自噬流所在的阶段以及强弱。我们可以看出,通过一个pH敏感的Keima可以检测各个阶段的自噬流。类似的,我们也可以把Keima定位到自噬小体(LC3-Keima)、ER、高尔基体、核糖体、过氧化物酶体等其他细胞器,从而方便的研究这些细胞器如何参与自噬的发生。

 

                                                                                       

 

图1,小鼠MEF细胞转染线粒体定位的Keima(mito-mKeima)。然后其中一组用氯化铵处理24 hr,分别定量550/438比值的变化。其中比值较小(显示为绿色)处代表中性pH的线粒体或者线粒体/自噬小体,比值较大处(显示为红色)代表pH较低的自噬溶酶体。氯化铵的加入破坏了溶酶体的酸性环境,因此mito-keima标记的细胞器不再会遇到酸性环境,比值维持一个较小值且保持不变。

 

 

自噬流荧光数据的处理 

作为一般性的原则,刺激后(包括药物、处理、基因操作等手段)的实验组中如果自噬现象与对照相比非常显著,该情况下不对其做定量化处理也是可以的,毕竟肉眼能看出来的差别才是最大的差别。

 

即使如此,如果一定要对其进行定量化处理,我们在此推荐一个应用最广、操作也相对简单的定量方法-计算细胞内的自噬相关点(红点、绿点,甚至黄点)的平均数目,然后做柱状图即可。我们看几个例子。

 

图2所示的是RFP-GFP-LC3双标探针标记的HeLa,经Chloroquine和Leupeptin A分别处理后,形成不同程度的自噬。图像采集后我们对自噬进行定量处理。

 

方法就是随机选定比如30个细胞,然后计数胞内的红色和绿色点数,点数总数除以细胞数得到平均胞内点数,然后做柱状图即可。我们发现Chloroquine处理可以明显增加胞内的红色和绿色点数(对照的6~8倍);而Leupeptin A只会增加红色点数(~7倍),绿色点数只有轻微变化(~2倍)。

 

 

图2,利用RFP-GFP-LC3双标工具定量自噬程度。HeLa细胞经RFP-GFP-LC3转染后36hr,然后分别用对照(Vehile)、90 mM Chloroquine和200 mM Leupeptin A处理24hr,然后用绿光(488nm)和红光(587 nm)激光分别激发采集图像。我们分别选择绿色荧光通道和红色荧光通道荧光阳性的细胞分别计数胞内的荧光点(dots)数,并进行加和,然后计算每个细胞的平均荧光点数,并作图。

 

对于p62标记工具也是类似的处理方法。如图3,对于A549细胞,经Chloroquine处理16hr后点数是对照的~8倍(GFP-p62)和~5倍(RFP-p62)。似乎绿色荧光标记的p62更为灵敏一些。

 

 

图3,A549细胞转染自噬单标GFP-p62和RFP-p62 36hr然后用水(Vehicle)或60微摩的Chloroquine处理16hr。然后用绿光(488nm)和红光(587 nm)激光分别激发采集图像。我们选择荧光阳性的细胞分别计数胞内的荧光点(dots)数,并进行加和,然后计算每个细胞的平均荧光点数,并作图。

 

对于pH敏感的Keima成像也可以遵循类似的处理方式。比如图4所示,我们用mito-Keima来研究线粒体自噬的变化。无论是对于对照(A)和还是处理组(B),我们首先用440 nm激发并采集图像,标为绿色(颜色可以定制,因为是伪彩);然后用550 nm激发并采集图像,标为红色。两图重叠就可以得到图A和图B的图像。定量的话,只需要计算胞内红色点的平均数并作图即可(图C)。

 

 

图4,利用线粒体定位的Keima(mito-Keima)检测大鼠原代皮层神经元中的线粒体自噬。该图利用440 nm(显示为绿色,指示中性的pH)和550 nm(显示为红色,指示酸性的pH)分别激发并采集620 nm的图像,A代表对照,B代表PINKI过表达的红绿图像重叠的结果。C图是对过表达PINKI的野生型(WT)和激酶活性位点失活(KD)的神经元中红色点数(代表酸性pH值)的定量结果(平均每个细胞中的红点数目)。

 

 

展望

自噬已经被发现了50多年,但直至20世纪90年代大隅良典公布其研究结果后,其在生理学和医学领域的功能重要性才被意识到,大隅良典也因此被授予2016年诺贝尔生理学或医学奖。虽然自噬的研究在近年来取得了显著的进展,但仍然还有许多问题需要进一步研究。

 

例如,自噬体膜的来源、自噬体与溶酶体的融合机制及自噬相关基因的功能等。同时,自噬在肿瘤发生、免疫性疾病、神经退行性疾病和代谢性疾病等疾病中的作用和意义同样值得深入研究。

 

汉恒生物作为国内率先关注自噬研究并研发自噬工具的公司,拥有自噬研究的各种现货工具,可以为广大用户解决自噬研究中用到的各种疑难问题,有助于大家更方便、更快捷、更顺利地做好科研、申请基金,也希望通过对自噬这把双刃剑的研究,为人类对抗和最终解决自噬相关疾病带来新的希望。

 

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