选对克隆方式,为你的载体构建加速

做过分子实验的人可能都会有这样的经历:在经过N次的PCR、酶切、连接、转化之后,阳性率依旧很低,到底是哪一步出了问题?今天就给大家详解一下可以一步法快速构建同源重组载体,并且阳性率很高的方式:无缝克隆

 

无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法,可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入,而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接,只需要一步重组法,即可得到高效率克隆的重组载体,大大提高了工作效率。

 

我们先来将传统克隆与无缝克隆做下比较:

无缝克隆相较于传统克隆的方式,『优势』显而易见,,主要体现以下几点:

 

1、 可以不需要任何限制性内切酶、连接酶,也不需要磷酸化、末端补平等操作;

2、 可同时连接多个DNA片段,最多可达10个;

3、 不附加任何多余序列,精确定向连接;

4、 体系反应时间仅需20min,快速反应。

 

那无缝克隆到底应该怎么做呢?下面我们就来详细了解下无缝克隆其原理:

在基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增阶段,与常规PCR法是相同的。唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基,由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。