科学家们都选它做CAR-T?慢病毒载体进化史

提起细胞治疗,最好的例子就是用基因工程改造,治疗癌症的CAR-T细胞,它也被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

2019年8月,中国国家药监局药品审评中心(CDE)正式受理了由诺华提交的CAR-T疗法CTL019(Kymriah)的临床试验申请,这也是全球首款获批的CAR-T疗法临床试验申请在华获得受理。而这其中用于感染T细胞的病毒载体就是慢病毒载体。

那么慢病毒载体究竟具有哪些独特的优势吸引了科学家的注意力呢?下面我们就来深度剖析一下吧~

 

慢病毒载体的结构

提起慢病毒包装,好多人只知道质粒共转染293T细胞,又或者对穿梭质粒、辅助质粒傻傻分不清楚,那么现在就从慢病毒的基因组入手,讲解一下病毒包装的原理:

首先它的基因组可以分为三个编码病毒基本结构的【结构基因】:gag、pol、env;

六个【调节基因】:tat、rev、nef、vif、vpr、vpu。

但后来大家发现6个调节基因中有些只对野生型的HIV有用,于是只保留了调节基因中的tat和rev

 

其中gag基因编码病毒的核心蛋白如核衣壳蛋白、内膜蛋白和衣壳蛋白;pol基因编码病毒复制相关的酶;env基因编码病毒包膜糖蛋白。

调节基因tat、rev主要负责病毒的转录和翻译,这六种基因对于病毒包装都必不可少。

在基因组两端的LTR结构可以简单地理解为启动子和终止子。

可以看出,慢病毒虽然属于逆转录病毒科的一种,但其结构和基因组的复杂程度远超其他逆转录病毒。这也使得慢病毒具有独特的整合机制和病毒感染持久性。

这也解释了为什么科学家更倾向于选择慢病毒作为感染T细胞的病毒载体:

 

更有效地感染分裂及非分裂的细胞;

 

更大的包装容量、更好的免疫效果;

 

更低的细胞毒性和免疫原性。

 

慢病毒载体的发展过程

由于慢病毒是具有复制能力的,直接用于细胞治疗会有致瘤性。于是为了避免有复制能力病毒(RCV)的产生,我们将LTR中间部分替换为目的基因,再把替换掉的、病毒不可或缺的部分分装进不同的质粒系统中,共转染进细胞。

最终我们就可以获得只有一次感染能力而无复制能力的HIV-1载体颗粒,也就是人类免疫缺陷I型病毒。

到目前为止,慢病毒载体的设计大约经历了以下几个阶段:

 

❶ 两质粒系统

以HIV-1为骨架,将其中的反式作用蛋白基因序列去除,然后包装成为含有目标基因的重组质粒和能够反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒,共转染包装细胞(如293T细胞)进行包装。但这个系统由于存在产生野生型HIV的危险,现在已经不再使用。

 

 三质粒系统

包括包装质粒、包膜质粒和载体质粒。是目前最适用,最流行的。该系统的transfer质粒中利用的LTR是病毒本身的,没有加以改造。因此启动子活性偏弱,需要Tat蛋白辅助表达。

 

 四质粒系统

与三质粒系统相比,第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上;第二个变化是将tat基因去除,并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5'LTR,以启动载体质粒的表达,虽然更安全,但滴度不如三质粒系统高,目前部分实验室在用。

 

通常,三质粒系统能够兼容四质粒系统transfer 质粒,反之则不可以。

 

汉恒生物提供的质粒系统就是“三质粒系统”:组成为辅助质粒psPAX2pMD2.G和穿梭质粒pHBLVTM 

 

其中psPAX2主要提供gag、pol、tat、rev,pMD2.G提供VSV-G。这是由于env基因编码病毒包膜糖蛋白感染性有限,因此替换成感染亲嗜性更强并且更稳定的囊泡性口炎病毒包膜糖蛋白G。

穿梭质粒一般含有LTR,中间可以插入我们的目的基因并进行克隆。

 

汉恒生物“三质粒系统”慢病毒:滴度更高(可达10TU/ml)、转染效率更好

 

目前汉恒生物的慢病毒产品已登上过GastroenterologyCirculation ResearchJCI等权威期刊

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

文章链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30365932/(IF=20.773)