从小白到大神 -【慢病毒疑难解答】

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,可有效地感染分裂细胞和非分裂细胞,所以慢病毒载体能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率,能够方便快捷地实现基因的长期、稳定表达。

 

在使用慢病毒的过程中,可能因病毒的浓度、细胞的状态、操作规范和时间把握等出现各种问题,今天小恒就来和大家聊一聊在使用慢病毒过程可能会遇到的问题,如何解决这些问题~

 

 

 

1、什么是MOI?如何通过MOI计算需要加入的病毒量?

MOI,感染复数,是指每个细胞感染的病毒数,通常需要MOI值越高的细胞越难被感染。一般我们把某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。

相关计算公式:每孔加病毒量(μL)=MOI*细胞数/病毒滴度(TU/mL)×1000

MOI=(病毒滴度x病毒体积)/细胞数目

 

2、如何确定向细胞中加入慢病毒的最佳时间?

慢病毒感染细胞后2~3天可观察慢病毒携带的基因荧光表达情况,在细胞汇合度30~50%且细胞状态良好时加入慢病毒,确保在感染后2天时细胞增长达到70%左右的汇合度。

 

3、用于慢病毒感染的细胞接种量是多少?

根据细胞增殖的速度调整细胞接种量,以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。

针对大部分细胞系:传代周期在2~3天,感染时细胞铺板的密度保持在30~50%左右

针对某些原代细胞:由于细胞增长缓慢,可以在接种时提高汇合度到70~80%左右

针对非分裂细胞:如神经元细胞,接种后不再增殖,此时可以按照100%的汇合度进行接种。

 

4、慢病毒感染细胞后什么时间基因表达到达峰值?

慢病毒感染后大部分细胞会在3天左右GFP或目的基因表达达到峰值,但是对于生长缓慢的细胞,达到峰值的时间会更长。

 

5、对照病毒或目的病毒感染细胞以后,细胞形态发生改变或者细胞死亡?

首先,确定病毒是否有污染,常见污染类型及处理方法:

① 细菌污染,病毒用Millipore 0.22um滤器过滤去除细菌;

② 真菌污染,病毒直接丢弃

③ 支原体污染,可用汉恒抗支原体试剂

汉恒慢病毒产品严格质检,确保慢病毒产品没有支原体污染。市场上有些慢病毒供应商为了降低成本缩短周期,削减支原体污染检测工序,不仅影响客户的实验成败,更给客户细胞房污染造成潜在影响。

④ 病毒纯度不够:与供应商联系确认慢病毒产品是否经过超速离心纯化!目前市场上很多低价慢病毒产品仅经过初步纯化,未使用超速离心机进行纯化;

汉恒慢病毒产品全部经过超速离心纯化,尤其适合对杂质敏感的细胞株!

其次,确定病毒感染MOI是否过高,降低MOI值,并在感染后的4h、8h、12h对细胞进行观察,若发现细胞状态变差时,则需要使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。

排除以上因素后细胞状态仍然不好,尝试增加血清含量,观察细胞状态是否好转。

 

6、如何提高慢病毒对细胞的感染效率?

慢病毒对细胞的感染效率受多种因素影响,如病毒活性、细胞自身的状态、MOI值、感染时间等。

①病毒活性,解冻病毒一定要在冰上进行,尽量避免反复冻融。-80℃保存半年以上需要重新测滴度;

②目的细胞,先进行预实验测试,看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞,如贴壁不好的细胞,原代细胞等适合用腺病毒;对于悬浮细胞,可采用离心感染的方法,减少病毒感染时的体积,从而提升感染的效率;

③ MOI值,进行MOI梯度摸索实验,找出最优的MOI浓度;

④ 感染时间,慢病毒/逆转录病毒一般在感染后24h换液,太早换液会导致感染效率下降;换液太晚,则对细胞的损伤太大。感染后48h开始观察荧光,由于慢病毒表达时间较长,有的72h、120h才能看到荧光;

⑤ 助转剂,Polybrene有一定的细胞毒性,不同细胞对polybrene的敏感度不同,可以用1-10ug/mL的范围筛选合适的浓度,以24h内细胞无明显毒性反应为佳;

PS:慢病毒带puromycin抗性的可以用嘌呤霉素筛选,也可提高阳性细胞率。

 

7、细胞能被慢病毒感染,但为何GFP荧光很弱?

GFP慢病毒感染细胞后,荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP前的启动子活性等因素。

GFP基因荧光表达的强度与启动子的活性、目的细胞感染的病毒颗粒数呈正相关。慢病毒在增值较快的细胞中感染72~120h,GFP蛋白表达才达到峰值;在增殖较慢的细胞中感染后,GFP蛋白表达到达峰值需要更久。GFP基因接在强启动子后面时荧光表达较强,弱启动子则荧光表达较弱。

观察荧光时最好关掉室内灯光,只留荧光显微镜光源。

 

8、为什么过表达慢病毒比对照的荧光要暗?

每种病毒有自己的载体容量,基因的插入会影响位于其下游的荧光蛋白等基因的表达。

对照病毒或干扰病毒,由于没有插入基因或者插入基因非常短,荧光通常较强。而插入了较长基因之后,荧光的亮度会随着插入基因的长度以及特殊结构的存在等而减弱,尤其是出现高GC片段,由于影响了转录,荧光强度会大大降低。

其次,对照病毒相对滴度可能比对照高,同等体积的病毒,对照的病毒量大,可能对细胞的影响大。

第三,有些病毒供应商对照和目的病毒的纯化工艺可能不一致,导致目的或者对照病毒对细胞毒性大。

汉恒生物所有病毒同样的纯化工艺,病毒无支原体污染,质控严格。

 

9、要曝光很长时间才能观察到荧光?

可能的原因有:

① 显微镜汞灯使用时间长,可以通过对照病毒排除,若对照较亮可排除显微镜问题;

② pH值低,看培养基是否发黄,pH值较低会导致绿色荧光淬灭

③ 目的病毒光不亮,插入目的基因后的病毒荧光强度会相较对照弱一些,属于正常现象,可加长曝光时间。

 

 

汉恒生物一直致力于为科研工作者提供优质的产品和服务,所以我们在慢病毒工艺上不断优化,在保证病毒滴度的同时,提升病毒纯度,并且生产过程中严格控制,确保给客户提供优质的无支原体污染的病毒。

在汉恒的努力下,我们的病毒质量也获得了很多客户认可,细心的客户还给我们反馈了产品质量对比图: