gRNA无效?单克隆无法获取?轻松“KO”敲除细胞株的烦恼!

CRISPR/Cas系统全称为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins),这一系统是源于细菌中的一种后天免疫系统(图1)。该系统可以把侵入细菌的噬菌体遗传物质整合到自身基因组一个或者多个CRISPR位点作为永久的“记忆”,当细菌被再次入侵的时候,CRISPR位点被转录生成CRISPR RNAs(crRNAs)。crRNA随后会引导DNA剪切酶Cas9根据序列互补的原则剪切入侵的外源核酸序列,消灭外来遗传物质,发挥保护功能。

简而言之,源于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术被工程化为一段介导定位作用的RNA序列(guide RNA和crRNA合二为一的杂合RNA序列,称为gRNA)加上一个DNA水解酶Cas9组成的二元系统。


 

CRISPR/Cas9系统具体包括适于哺乳动物表达的Cas9基因和定位作用的gRNA(图2)。方便起见,研究者把这两者放在了一个载体之中(all in one plasmid)。如果计划利用这一系统编辑某个目的基因,我们唯一要做的就是定制一条有效的gRNA。这一革命性的基因编辑技术极其强大,可以在一般的分子实验室进行基因的敲除(KO)、基因组片段的删除、碱基位点矫正、大片段的敲入(KI)等操作。

 

 

其中KO由于其操作步骤简单方便,效果也相比较shRNA基因干扰稳定,所以基因功能研究中,越来越多的科研人员选择构建敲除的单克隆细胞株。本文我们简要介绍利用CRISPR/Cas9技术建立基因敲除细胞系的流程以及实验中的难点。

 

KO建系流程

1、确定要敲除的基因,选择合适的细胞系;

首先根据科研内容选择目的基因,细胞优先选择容易建系且单克隆挑选容易的细胞系,建议先做质粒转染或者慢病毒感染预实验(本文以慢病毒为例)、单克隆挑选以及抗性筛选预实验和目的基因的本底表达检测,俗话说“磨刀不误砍柴工”,前期预实验都是为了后续的实验顺利开展。

 

2、设计gRNA;

gRNA设计有很多网站可以参考,放入序列后,通过网站评分选择就好。这里推荐两个小恒用的比较多的网站:

http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp

http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html

 

3、构建Cas9-gRNA 载体,包装慢病毒;

选择合适的载体构建载体质粒,并包装慢病毒,小恒用的比较多的是lentiCRISPR v2这个慢病毒载体

 

4、病毒感染目的细胞,荧光或者抗性筛选混合克隆

包装好的慢病毒按照合适的moi感染目的细胞,用病毒带的荧光或者抗性标记筛选被感染的阳性细胞,得到混合克隆

 

5、混合克隆抽取基因组DNA,鉴定切割效果

提取混合克隆细胞基因组DNA做PCR测序鉴定套峰或者T7E1鉴定切割效果

 

6、选取有切割效果的混合克隆挑取单克隆

对有切割效果的细胞进行单克隆挑取,可以通过96孔板进行有限稀释获取单克隆;也可以将细胞铺到100 mm dish里,一周后挑取获得单克隆(这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系,但是挑取的单克隆偶尔不纯,有时需要重新亚克隆);如载体带有GFP等荧光标记,还可以通过流式细胞仪直接分选,把单个细胞种到孔板中从而直接得到单克隆。

 

7、单克隆细胞株鉴定

取单克隆细胞抽取基因组DNA做PCR测序,明确DNA序列的具体变化,确保得到纯合敲除细胞株。

 

到这里,一个完美的敲除细胞株就构建成啦,虽然看似简单,但实际操作过程中,可能会遇到各种各样的问题,例如:

 

1、gRNA验证无效

虽然gRNA设计的网站众多,操作简单,但总会遇到设计出来的gRNA没有编辑效果的情况,遇到gRNA无效的情况,首先可以考虑增加gRNA数量,可以根据实验室和自身经验选择设计的gRNA数量,一般建议至少三条;另外还要考虑cas9的有效性,验证cas9是否表达正常。

 

2、转染效率低

KO实验需要的是gRNA和cas9蛋白同时在细胞内表达,无论用哪种载体必须要保证一定的转染效率。常规质粒转染方法包含:脂质体转染,电转,以及慢病毒、腺病毒等病毒载体感染细胞。若质粒转染效率低,可以考虑用感染效率更高的病毒载体来递送gRNA和cas9。另外对于cas9和gRNA放在一个载体上难转染的细胞,也可以尝试将两者分开,分别构建载体或者包装病毒进行细胞转染,如果想在一个细胞上敲除多个基因,先筛选一个cas9过表达的稳定株,后续根据实验需求导入不同基因的gRNA也是个不错的方法。

 

3、无法获取单克隆

敲除细胞株的主要限速环节是挑单克隆。基因敲除,挑单克隆才能达到纯合敲除目的。对于依靠切割后细胞自身修复的Cas9技术,产生有效移码突变是有概率的,需要修复后插入或缺失的碱基不是3的倍数才行,在此基础上还要保证是等位基因同时编辑(有些基因完全敲除后细胞会死,那么也可以用只编辑一个等位基因)。但实际情况是很多细胞单克隆难以形成,对于这个情况,一是要选取合适的细胞来做敲除建系,细胞代数尽量低确保细胞有足够的活力,二是可以选择多种挑取单克隆的方法来尝试。

 

汉恒生物拥有丰富敲除细胞系构建经验,可以实现彻底敲除目的基因的目标

 

我们的优势:

·种子优良--严选低代数细胞来源,无支原体无黑胶虫
汉恒生物所有的细胞均从中科院细胞库购买,代数低无污染,还可以提供STR检测报告。


·简单高效--慢病毒系统,提高感染效率,缩短实验周期
汉恒生物采用慢病毒系统转染目的细胞,提高感染效率,更高效快速的挑选KO细胞。


·性状稳定--严酷的筛选及靶基因敲除验证体系
汉恒生物所有的敲除单克隆都通过构建T载体进行测序验证,清晰看出DNA序列的具体变化,确保敲除性状稳定不恢复。


·活力无损--严格的质控指标,建系后连续3代细胞增殖活力评估