从质粒构建教你做基因敲除

lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布的一个慢病毒载体,cas9和sgRNA表达框在同一个载体上,而且Cas9的C端带有FLAG融合标签,载体包含Puromycin抗性基因,适合建系。验证sgRNA活性的时候也适合瞬转;包装成慢病毒适合常规细胞系的建系,构建非常方便。

 

 

 

 

LentiCRISPR v2应用指南

 

网址:https://www.addgene.org/52961/

 

 

克隆gRNA使用BsmBI位点,载体可以切出一个~1.9 kb的filler片段,便于confirm酶切成功并利于载体回收;

 

BsmBI的位点是       ,酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连!

 

Cas9的C端带有FLAG tag,可以WB或者Immunostaining

 

EF1-a promoter被优化的小而强,极大提高了慢病毒包装的效率

 

载体带有Puromycin抗性,可以富集转染/感染成功的细胞。

 

 

 

 

如何设计gRNA

 

 

gRNA设计方法和原则请参考上第一步“lentiCRISPR v2应用指南”,链接如下: https://www.addgene.org/52961/

 

对于lentiCRISPR v2克隆,其合成的oligo末端和pX330不同,请注意设计;

 

 

举个例子说明(克隆小白千万注意oligo的方向)

 

 

 

 

如何克隆载体

 

 

Backbone的酶切体系同上方步骤“ 如何设计gRNA“(说明:不脱磷处理参考黑框,脱磷参考红框内操作)

 

Oligo的退火条件也参考上方步骤(说明:如果载体不脱磷,oligo不需要磷酸化;载体脱磷参考红框内操作,oligo就需要加磷处理!!!(红色框内是FengZhang提供的protocol,设计脱磷,仅作为参考) 

 

 

 

仅作参考

 

 

 

病毒包装体系

 

 

包装病毒使用的包装体系如下(for 100 mm dish,6x106  293T)

 

转染条件:用汉恒生物的细胞转染试剂  LipoFiterTM

 

收集48hr和72hr病毒上清,待用。

病毒包装的protocol非常多,小编只列了基本的信息。后续会出详细写慢病毒包装步骤的干货!

 

 

 

目的细胞系的感染/转染

 

 

转染 (2 μg  plasmid/60 mm dish,细胞密度60-80%)

 

 

 

【v2=lentiCRISPR v2,下同】

 

 

 

 

感染 (1-5 ml病毒上清)【v2=lentiCRISPR v2,下同】

 

 

 

 

 

PCR测序产生的套峰示意图