如何用cas9做敲入

Cas9介导同源重组(HDR)除了需要多引入一条修复模板(repair template),基本操作和做基因敲除(KO)基本一致(Fig 1)。顺利的情况下整套操作下来至少需要4周时间(心急吃不到热豆腐嘞~~),其中单克隆的获取和鉴定是最大的限速步骤。

 

WT的Cas9 (这里指spCas9)是引起双链断裂(DSB),进而引起NHEJ(nonhomologous end joining,意思就是断裂的末端重新连起来,这一过程容易产生indels)或者HDR(修复模板存在);但有一个突变体(D10A)却只保留了切口酶的活性(nickase) (spCas9n),一般不会引起NHEJ,但会引起HDR(修复模板存在)。大家周知WT的spCas9会有些微的脱靶效应,因此利用cas9n代替WT的cas9产生deletion(需要两条sgRNA同时作用)或者HDR可以降低一部分脱靶的效果(Fig. 2)。

 

 

 Fig 1. Cas9敲除/敲入基因时间安排

 

 

Fig 2. Cas9 (D10A)突变体(Cas9n)只保留nickase活性

 

 

这一突变体不会引起NHJE。如果同有两条sgRNA靶向一个gene的不同位点,Cas9n会引起一个片段(两个sgRNA之间)的deletion。修复模板存在的情况下可以引起HDR。

 

今天的内容主要讲讲利用Cas9怎么做同源重组(修复)(HDR)。其实基因的敲入(KI)也是一模一样的做法。

 

 

 如何利用Cas9做同源重组 

 

 

 一、同源臂的设计

 

 和做KO比较,做HDR最大的不同就是要有同源模板的存在。同源模板有以下两种类型(Fig. 3):

 

 

1、单链模板:手动设计单侧同源臂长度不低于40 nt,但强烈推荐设计~90 nt。找引物合成公司合成较长单连oligo即可(90+90+Insertion),针对正链或者反链合成都ok。没有必要使用PAGE纯化。为了验证方便,建议引入酶切位点(RFLP法)。当然,同源模板也可以是线性化的双链DNA片段,可以通过线性化载体或者基因合成/PCR获得。溶解成终浓度10 mM,-20°C分装保存。

 

2、线性化双链模板:同源臂在1000 nt左右;线性化载体或者PCR产物作为转染模板。

 

 

二、转染

 

★ 12孔板:2 ✕ 105 cells/well (50-70% confluency)

★ 500 ng Cas9(或者Cas9n)-sgRNA

★ 1 μl单链同源模板(10 μM)

 

 

三、鉴定方法

 

通过GFP或者puromycin富集成mixture,然后直接PCR测序或者利用Restriction-fragment length polymorphism (RFLP) 分析方法。

 

 

 四、结论

 

1、WT的Cas9直接切割双链,引起DSB,重组效果最好,但会引起脱靶;

2、单链oligo作为模板优于线性化载体作为模板; 

3、貌似反义 oligo的模板效果优于正链。 

 

 

Fig 3. Cas9介导同源重组

 

 

 

参考文献:

1. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, and Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013;8(11):2281-308.

 

2. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, and Jaenisch R. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013;153(4):910-8.

 

3. Wu Y, Liang D, Wang Y, Bai M, Tang W, Bao S, Yan Z, Li D, and Li J. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 2013;13(6):659-62.

 

4. Swiech L, Heidenreich M, Banerjee A, Habib N, Li Y, Trombetta J, Sur M, and Zhang F. In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 2015;33(1):102-6

 

5. Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem O, Wu X, Makarova KS, et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 2015;520(7546):186-91.

 

6. Nelson CE, Hakim CH, Ousterout DG, Thakore PI, Moreb EA, Castellanos Rivera RM, Madhavan S, Pan X, Ran FA, Yan WX, et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 2016;351(6271):403-7.