双荧光素酶检测试剂盒

 

 

产品包装和保存条件

 

 

 

试剂盒于-20℃保存。Lysis Buffer -20℃可保存一年。反应试剂(Luciferase Reaction Reagent和Luciferase Reaction Reagent II)加入底物后,分装、避光保存;-70℃可保存一年,-20℃可保存一个月;避免反复冻融。试剂使用前需平衡至室温。

 

 

实验原理

 

  萤火虫萤光素酶(firefly luciferase, fluc)和海肾萤光素酶(renilla luciferase, rluc)可分别催化萤光素(luciferin)和腔肠素(coelenterazine)产生生物萤光反应,反应过程如下图所示。

 

 

 

 

在双萤光素酶反应中,首先用Luciferase Reaction Reagent检测fLuc信号;随后,直接加入Luciferase Reaction Reagent II,将fLuc的信号猝灭,同时产生rLuc信号。该方法具有操作简单、检测快捷、灵敏度高等优点。

 

 

实验步骤

 

1.配制试剂

 

(1)Lysis Buffer:

Lysis Buffer (5X) 用水稀释5倍,配制成工作液;

 

(2)Luciferase Reaction Reagent:

用Luciferase Reaction Buffer(10 ml)溶解Luciferase Reaction Substrate干粉(短暂离心再开盖),混匀后分装、避光保存,避免反复冻融;

 

(3)Luciferase Reaction Reagent II:

用Luciferase Reaction Buffer II(10 ml)稀释、混合Luciferase Reaction Substrate II(短暂离心再开盖),分装、避光保存,避免反复冻融。

 

2.裂解细胞

 

细胞裂解时密度应小于95%,细胞生长过密,易导致裂解不充分;质粒瞬转、病毒感染细胞后,需培养一段时间(一般48小时)使萤光素酶充分表达;调节实验参数,以满足上述条件;

 

去除培养基,用PBS润洗一遍,注意不要将细胞吹起;加入适量的1X Lysis Buffer,推荐用量见下表;

 

 

 

将细胞培养板置于摇床上,室温、轻晃孵育15分钟;

 

将裂解物转移到新的EP管中,4℃、12,000rpm离心1分钟,取上清备用。

 

3.萤光检测

 

取20μl裂解物,加入100μl平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent,混匀后于酶标仪中检测fLuc信号;

 

然后加入100μl平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent II,混匀后于酶标仪中检测rLuc信号。

 

Chinese, Simplified
 
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