Bone Reaserch丨关节炎早期干预新策略——LATS1-ZBTB20轴如何成为软骨救星

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性关节疾病，其病理变化包括关节软骨的颤动和退化、软骨下骨硬化、骨赘的形成以及炎症反应。目前，药物治疗以缓解疼痛为主，暂无改善疾病的治疗方法。因此，识别和定义OA早期阶段的细胞和分子级联反应将有利于OA初始阶段的诊断和治疗，最终促进关节稳态的恢复。ZBTB20作为ZBTB蛋白家族成员，具有转录抑制作用，参与器官发育及代谢调控，其在关节软骨中通过抑制Sox9调节肥厚性软骨细胞的终末分化。然而，ZBTB20在OA病理发展中的功能仍不清楚。

西安交通大学及西北大学颉强团队、第四军医大学杨柳团队联合在Bone Reaserch（IF:14.3）上发表研究论文《LATS1-modulated ZBTB20 perturbing cartilage matrix homeostasis contributes to early-stage osteoarthritis》，发现ZBTB20在OA早期易位至细胞核，其核内聚集水平随着病程发展逐渐减弱；ZBTB20通过抑制Pten表达，激活PI3K-Akt-NF-κB信号来破坏细胞外基质（ECM）的代谢平衡；此外，ZBTB20的亚细胞定位和转录活性可被上游调控因子LATS1调节，应用LATS1抑制剂TRULI和SGLT2抑制剂DAPA干预可有效逆转由ZBTB20介导的ECM代谢紊乱，缓解OA发展和软骨退化。在本研究中，作者使用汉恒生物提供的cre过表达重组腺病毒Ad-Cre-GFP实现了Zbtb20fl/fl小鼠原代软骨细胞的Zbtb20基因敲除、Zbtb20过表达重组腺病毒Ad-mZbtb20-GFP感染野生型原代软骨细胞实现了Zbtb20的外源性过表达。

接下来，我们一起看看本研究的主要结果。

首先，作者使用白细胞介素-1β（IL-1β）处理原代软骨细胞建立了体外炎症模型，选取0、6 h（快速反应）、48 h（长期反应）时间点进行转录组测序（RNA-seq）和染色质可及性分析（ATAC-seq）。对各组中TF结合基序的分析结果显示，6 h组富集了具有锌指结构域的转录因子，提示锌指蛋白被激活。单细胞测序结果显示锌指蛋白ZBTB20这一具有炎症反应调节功能的基因在软骨细胞簇中显著表达。作者通过小鼠内侧半月板失稳（DMM）手术构建OA模型，对关节软骨切片进行免疫荧光染色，证实了术后2周软骨细胞中的ZBTB20发生核转位，随着病程发展核转位逐渐减少，这一变化与COLII相关。在体外培养的软骨细胞中，ZBTB20的蛋白水平在IL-1β刺激后表现出下调趋势。为了排除个体异质性干扰，作者使用同一OA患者胫骨平台两侧的软骨进行对比，免疫组化结果显示受损区域ZBTB20的表达显著降低。这表明ZBTB20的激活与OA早期的发病机制之间存在强相关性。

图1 转录因子ZBTB20在OA早期被激活

为进一步探究ZBTB20在OA病理进程中的功能，作者使用野生型和诱导型软骨特异性ZBTB20敲除小鼠构建OA模型。他莫昔芬注射2周后进行内侧半月板失稳（DMM）手术，组织学分析显示野生型小鼠OA模型组增生性软骨细胞数量的增加、OARSI评分升高、骨赘体积和软骨下骨板厚度的增加，提示模型建立成功，而Zbtb20敲除减轻了这些症状。ECM合成代谢和分解代谢的不平衡是软骨退化的主要原因，因此，作者检查了参与ECM稳态的蛋白的表达。免疫荧光染色结果显示Zbtb20敲除可显著恢复由DMM手术所引起的软骨ECM成分（COL II和ACAN）的减少，以及ECM降解酶（MMP13和ADAMTS5）的异常表达。此外，使用Cre腺病毒在Zbtb20f/f小鼠分离培养的软骨细胞中敲除Zbtb20抑制了IL-1β诱导的ECM稳态破坏，包括抑制MMP3、MMP13、ADAMTS5的异常上调和COL II的异常下调，而Zbtb20过表达则加剧了稳态的破坏。这些发现共同表明ZBTB20可通过破坏ECM稳态来加速OA疾病发展。

图2 ZBTB20的下调减弱OA发展

在前期实验中，作者发现NF-κB信号在IL-1β处理的软骨细胞中特异性上调，且Zbtb20缺失抑制了NF-κB信号激活，这表明ZBTB20可能触发了NF-κB信号传导。为了阐明ZBTB20激活NF-κB信号的潜在方式，作者对比WT和Zbtb20敲除软骨细胞的转录组差异，结果显示差异基因在PI3K-Akt信号通路中高度富集，WB结果显示IL-1β处理和过表达Zbtb20均可显著上调AKT蛋白磷酸化水平，而敲除Zbtb20抑制了IL-1β诱导的AKT蛋白磷酸化水平上升，这一结果提示PI3K-Akt信号是ZBTB20的下游效应通路。通过CUT&Tag-seq和ChIP-qPCR分析，作者发现Pten基因是ZBTB20与PI3K-Akt信号通路之间的关键调控因子，ZBTB20可与Pten的启动子区域结合。Zbtb20过表达或敲除的软骨细胞中的功能实验显示，PTEN表达变化与p65（NF-κB亚基）磷酸化呈负相关，进一步表明了ZBTB20对PTEN的抑制作用。此外，RT-qPCR的结果显示在IL-1β诱导的软骨细胞中，SC79（PI3K-Akt信号激活剂）破坏了Zbtb20敲除介导的ECM稳态恢复，MK2206（PI3K-Akt信号抑制剂）则恢复了Zbtb20过表达诱导的ECM稳态失衡。这些结果表明NF-κB介导的ZBTB20对ECM稳态的干扰需要ZBTB20抑制Pten表达，激活下游PI3K-Akt信号。

图3 ZBTB20通过抑制Pten激活NF-κB信号

研究团队在观察ZBTB20细胞亚定位时发现，软骨细胞中ZBTB20的细胞核积累以IL-1β剂量依赖性增加。基于果蝇研究中Warts激酶（又称LATS1）直接与ZBTB20同源物Lola相互作用的机制基础，作者探索了LATS1对ZBTB20的调控作用。WB结果显示IL-1β处理的软骨细胞以及DMM诱导的OA软骨中LATS1的磷酸化修饰增加；使用Flag-ZBTB20/Myc-LATS1共转染的Co-IP实验和TurboID临近标记技术的结果均验证了ZBTB20和LATS1之间存在相互作用，并且该作用可被IL-1β抑制。此外，TRULI（LATS1/2抑制剂，可抑制LATS1磷酸化）可抑制IL-1β诱导的ZBTB20细胞核积聚。这些结果共同揭示了，激酶LATS1可被IL-1β诱导磷酸化，通过减弱与ZBTB20的相互作用，进而驱动ZBTB20核易位以执行转录调控功能。

图4 LATS1调控ZBTB20的细胞亚定位

接下来，作者评估了靶向干预策略恢复ECM平衡的可行性。结果表明，TRULI在IL-1β诱导刺激下以剂量依赖的方式恢复了的ECM的合成、阻断了ECM的降解。另一种潜在的Zbtb20治疗药物达格列净（DAPA）可在IL-1β处理的软骨细胞中抑制Zbtb20表达，上调PTEN表达，并以剂量依赖性方式恢复ECM平衡。免疫荧光与WB分析证实，TRULI和DAPA抑制了IL-1β诱导的p65核转位。综上所述，靶向LATS1-ZBTB20信号轴或直接抑制ZBTB20表达的两种独立策略均可通过触发NF-κB信号传导，恢复ECM稳态。

图5 TRULI和DAPA恢复软骨细胞的ECM稳态

前期研究已经证实DMM术后两周是OA发病机制的关键阶段，在此期间LATS1磷酸化，引起ZBTB20发生核转位。为了评估TRULI和DAPA在体内的潜在保护能力，作者评估了手术后立即给药和手术后2周给药的小鼠行为和组织病理变化。行为学结果显示，DMM手术导致小鼠腿部的绝对爪角增加、爪面积减少、站立时间缩短和摆动时间延长，手术后立即或2周后使用TRULI或DAPA可改善异常行为；在病理上，给药组的软骨基质丢失和软骨外围侵蚀均得到改善。在体外培养人软骨外植体的研究中，番红O（Safranin O）染色结果显示：TRULI或DAPA可显著且剂量依赖性地改善由IL-1β导致的蛋白多糖表面侵蚀和丢失；二甲基亚甲基蓝（DMMB）测定结果显示：药物组中软骨的糖胺聚糖（GAG）释放被显著抑制。最后，作者对原代软骨细胞进行了RNA-seq分析，发现TRULI和DAPA治疗可抑制多种炎症相关的通路：TRULI主要影响细胞周期调控通路，而DAPA主要靶向蛋白聚糖和ECM受体相互作用。这些发现表明TRULI和DAPA可通过不同机制缓解OA发展。

图6 TRULI和DAPA均可缓解OA病程发展

综上所述，本研究探索了转录因子ZBTB20对早期OA炎症反应和ECM稳态的关键作用，发现ZBTB20通过抑制Pten激活PI3K-Akt信号通路，进而激活NF-κB信号，破坏ECM稳态，而激酶LATS1通过磷酸化调控ZBTB20的亚细胞定位，促使其入核激活下游炎症通路。研究还证明小分子化合物TRULI和DAPA可调控ZBTB20可恢复ECM稳态，改善OA症状，这发现提出了以LATS1或ZBTB20为靶点早期OA的诊断和治疗提供了新靶点和潜在药物。