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汉恒生物研发的Easy Cloning无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段 PCR 引物的 5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的 15~25 bp 同源序列。将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的 PCR 片段按合适比例混合，并加入 Easy Cloning Master mix，通过反应体系中 DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在 50℃反应 20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近 100%。
| 项目 | 详细信息 |
|---|---|
| 产品名称 | Easy Cloning无缝克隆试剂盒 |
| 货号 | HB-EC-20T |
| 存储及运输条件 | -20℃保存，冰袋运输 |
| 规格 | 20T |
| 有效期 | 2年 |
实验流程：
1、线性化目的载体（左上）；
2、PCR 获取目的片段。设计的引物5'需要和线性化载体末端有 15-25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段）；
3、按照一定比例把二者混合在HB-infusion的2X预混液内，50℃反应20min后直接转化E.coli即可。
| 无缝克隆 | 传统酶连法克隆 |
|---|---|
| 只需要一次反应即可完成定向克隆，省略酶切、连接等过程 | PCR引物设计需引入载体上的酶切位点，PCR产物再经过酶切、胶回收、连接后定向克隆到目的载体上；或进行TA载体连接 |
| 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点 | 需要查找合适的酶切位点，购买各种内切酶 |
| 连接片段之间不会引入任何其他序列 | 阳性率低 |
| 可以同时克隆多个片段 | 多个片段，通常只能分多次拼接 |
| 产品组成 | 使用次数 | 体积 |
|---|---|---|
| 2 x Easy Cloning Master mix | 20 tests | 200 μL |
| Positive linearized pUC vector (250 ng) | 5 tests | 25 μL |
| Positive control insert (500 ng) | 5 tests | 25 μL |
| 储存条件 | -20℃ | |
先检查质粒，测浓度和纯度，确认质粒是否抽提成功；
再检查PCR条件是否无误，例如是否漏加试剂或引物等；
菌落PCR存在假阳性的可能，挑几个新的菌落抽提质粒，重新进行检测。
克隆位点上下游20 bp区域内GC含量尽量在40%-60%范围内，避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。
会。线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，会产生较高的假阳性或抑制反应，均建议进行割胶回收纯化产物。
载体线性化不完全，可以通过加大内切酶的使用量、延长酶切反应时间，并使用胶回收纯化酶切产物等操作进行优化。
平板抗性不足，先检查平板抗性，若无问题则考虑抗生素失活问题，建议使用新制备的抗生素平板。
重组酶失活，建议更换新批次酶，全程冰上操作；
感受态细胞失效，建议用确认无误的相同抗性质粒转化，验证效率；
抗生素平板失效，使用新制平板并确认抗生素浓度；
试剂盒保存不当，可能导致阳性对照片段发生降解。
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