AAV-saCas9 在体基因编辑

在体编辑就是把 CRISPR 系统直接送进活体动物的目标组织，让基因在原地被敲掉。相比做一株全身性敲除小鼠，周期短、成本低，还能做到特定组织、特定时点。

难点不在敲除本身，在递送。AAV 是现在在体递送的主力载体，免疫原性低、不整合、能长期表达，但它装不下 SpCas9。所以这一页的第一件事，是讲清楚为什么用 SaCas9。

AAV 两个 ITR 之间的装载上限通常不超过 4.5 kb，去掉启动子、荧光标记、polyA 这些元件，留给外源片段的空间大约只有 2 kb。

SaCas9 来自金黄色葡萄球菌，序列明显比 SpCas9 短。它和 sgRNA、启动子一起装进单个 AAV 载体（All-in-one），一次注射就能把整套系统递进去。SpCas9 走这条路基本装不下，只能拆成双载体，两个病毒挤同一个细胞的概率就低了，效率跟着掉。

SpCas9 认 NGG，SaCas9 认更长的 NNGRRT。SaCas9 能设计的靶点位置更少，但反过来，SpCas9 靶点受限的位点，SaCas9 常常能给出新方案。sgRNA 设计阶段我们会按 SaCas9 的 PAM 特征重做，不会沿用 SpCas9 的设计。

SaCas9 用于 AAV 递送的方案源自 2015 年张峰团队发表在 Nature 的工作（Nature 2015, 520:186-191）。AAV 的包装容量与血清型完整数据见 腺相关病毒（AAV）包装。

AAV 各血清型的衣壳蛋白不同，对不同组织和细胞的亲和性差异很大。选血清型是在体实验的第一步，也是影响效果最大的一步。下面这张表按感染部位整理了常用血清型和给药方式。

上表为在体编辑视角的精简版，完整血清型列表、特异性血清型与注射方式见 特异性腺相关病毒。方案阶段请与我们确认当前可提供的血清型。

血清型决定的是病毒更容易进入哪些细胞，属于物理层面的递送效率。真正把表达限定在特定细胞类型，要靠组织特异性启动子，或者 Cre 依赖的表达系统。这两层是独立的，可以叠加。

同一个血清型，换条给药途径，分布结果可能完全不同。文献里的亲和性数据跟剂量、动物周龄、品系、给药方式都有关，落到自己的实验上建议先用报告载体做小量预筛。

启动子决定基因进入细胞后在哪些细胞里表达。用组织特异性启动子，可以把表达限定在特定细胞类型内，避免在非目标细胞里产生编辑。研究某个基因在特定细胞里的功能时，这一步是必须的。

完整启动子库与选择建议见 特异性腺相关病毒。需要某一组织但表里没有，方案阶段可以单独评估。

在目标组织里敲除特定基因，研究基因在整体动物水平的功能。相比全身性敲除动物模型，周期更短、成本更低，还能实现特定组织与特定时点的敲除。目前开放的是敲除类编辑。

结合 Cre 依赖的表达系统，在特定组织或特定时间点触发编辑。适合研究发育必需基因，或者要规避胚胎致死的情况。项目开始前需明确 Cre 来源与诱导方式。

同一载体上串多条 sgRNA，或者分装到多个载体。受 AAV 容量限制，数量需要方案阶段评估。

基因敲入（KI）与点突变类项目暂未开放，有相关需求可留言登记。体外细胞的编辑方案看 体外细胞水平 CRISPR/Cas9 基因编辑。

给药途径和血清型是绑在一起选的。尾静脉、局部注射、脑立体定位、鞘内、玻璃体腔、滴鼻雾化，不同途径对应的组织分布差别很大，选错了后面怎么调都补不回来。

尾静脉注射，全身性递送，肝脏、心脏、肌肉分布好，操作最简单。

立体定位注射，绕开血脑屏障做局部脑区，需要手术操作。

鞘内注射，主要用于脊髓与背根神经节。

局部多点注射，心肌、骨骼肌原位注射，用量小、局部浓度高。

视网膜下腔 / 玻璃体腔注射，眼科相关研究。

气管内 / 滴鼻 / 雾化，肺脏递送。

AAV 介导的表达起效慢，标准单链 AAV 进入细胞后还要做第二条链合成，到峰值表达通常要一到三周。取样太早，什么都看不到；这一点在设计时间线时最容易被低估，也是项目返工的高发区。具体时长与血清型、启动子、给药剂量相关，会在方案里明确。

先明确目标组织、给药途径、动物品系与周龄，据此定血清型与启动子组合。这一步定错了，后面全白做。

按 SaCas9 的 PAM 特征重新设计 sgRNA，构建 All-in-one 或双载体方案，完成后测序验证。

完成包装与纯化并测定滴度。在体实验对病毒纯度和滴度的要求高于体外。

按方案给药，并预留足够的表达时间再取样。取样时间点的设计直接决定能不能观察到编辑效果。

取靶组织做 T 载体测序、WB、qPCR 或免疫荧光验证，非靶组织同步检测以评估特异性。交付病毒液、质控报告与验证结果。

在体实验的质控要求高于体外，无菌与内毒素是必检项，不做就等于把动物的状态押上去。

在体项目的成本结构跟体外不一样，主要差在血清型选择、给药途径和动物实验规模上。确认需求后给书面报价，不做统一标价。

血清型与载体方案，天然血清型、特异性血清型、All-in-one 还是双载体。

滴度与交付量，在体实验对病毒总量要求通常高于体外。

是否包含动物给药与组织取样，涉及动物实验操作环节的，成本另计。

非靶组织特异性检测的组数，验证越充分，成本相应增加。

周期要求，常规排期与加急排期的资源占用不同。

把靶基因、物种、目标组织、给药方式四项发过来，就能拿到含方案、周期和费用的书面报价。