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在体基因编辑是将 CRISPR/Cas9 系统直接递送至活体动物的目标组织，在组织原位完成基因编辑。与构建全身性敲除小鼠相比，在体编辑周期更短、成本更低，并可实现特定组织、特定时点的基因干预。
在体基因编辑的核心难点在于递送。腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）是当前在体递送的主力载体之一，具有免疫原性相对较低、不整合、可长期表达等特点，但其包装容量有限，无法容纳 SpCas9 全长。因此，本服务采用更小的 SaCas9，以实现单载体递送。
SaCas9与SpCas9的主要差异在于载体递送能力和PAM限制。SaCas9最大优势是CDS更短，适合单AAV all-in-one递送；SpCas9则靶点密度更高，但通常难以装入单载体，常需双载体策略。
| 项目 | SpCas9 | SaCas9 |
|---|---|---|
| CDS 大小 | 约 4.1 kb | 约 3.1–3.2 kb |
| PAM | NGG | NNGRRT（R = A/G）；SaCas9-KKH 为 NNNRRT |
| Cas9+gRNA同载体（all-in-one） | 通常难以装入，常需双载体或更小 Cas9 | 可配合短元件装入单载体，接近容量上限 |
| 靶点密度 | 较高 | 相对较低，需按 SaCas9 PAM 重新设计 |
| 常用策略 | 双载体、分裂 Cas9、更小直系同源物 | 单载体Cas9+gRNA（all-in-one），一次注射递送 |
SpCas9 通常需拆双载体，两病毒共感染同一细胞概率降低，编辑效率可能下降。
SpCas9 识别 NGG；SaCas9 的更长 PAM 可覆盖部分 SpCas9 不适用的位点。
在体编辑服务涵盖在体基因敲除、条件性敲除和多基因编辑三类，核心优势是周期短、成本低、可实现组织与时点特异，并可根据 Cre 依赖和 AAV 容量灵活设计。
In Vivo Knockout
在目标组织中敲除特定基因，研究该基因在整体动物水平的功能。与全身性敲除动物模型相比，在体敲除周期更短、成本更低，并可实现特定组织与特定时点的敲除。
Conditional Knockout
结合 Cre 依赖的表达系统，在特定组织或特定时间点触发编辑。适合研究发育必需基因，或者要规避胚胎致死的情况。项目开始前需明确 Cre 来源与诱导方式。
Multi-Gene Editing
可在同一载体上串联多条 sgRNA，或分装至多个载体。受 AAV 容量限制，靶基因数量需在方案阶段评估。
AAV 不同血清型的衣壳蛋白不同，对不同组织和细胞的亲和性差异显著。血清型选择是在体实验的第一步，也是影响递送效果的关键因素。下表按感染部位整理常用血清型和给药方式，供方案设计参考。
| 感染部位 | 推荐血清型 | 常用注射方式 |
|---|---|---|
| 心脏 | AAV9 | 原位多点注射 / 尾静脉注射 |
| 肝脏 | AAV8 / AAV9 | 尾静脉注射 / 肝门静脉注射 / 眼眶静脉注射 |
| 全脑（跨血脑屏障） | AAV-BBB / AAV-cap-B10 | 尾静脉注射 |
| 大脑（局部） | AAV9 / AAV2 / AAV5 / AAV8 | 立体定位注射 |
| 脊髓 | AAV9 / AAV1 / AAV5 | 鞘内注射 |
| 骨骼肌 | AAV9 | 原位多点注射 |
| 眼睛 | AAV2 / AAV-DJ | 玻璃体腔注射 / 视网膜下腔注射 |
| 视网膜 | AAV-anc80L / AAV-GL / AAV-NN / AAV-shH10 | 视网膜下腔注射 |
| 肺脏 | AAV5 / AAV6 / AAV-6.2FF | 气管内注射 / 气管插管注射 / 滴鼻 / 雾化 |
| 肾脏 | AAV2 / AAV9 / AAV-GEC | 肾实质注射 / 肾盂注射 / 尾静脉注射 |
| 胰腺 | AAV8 / AAV9 / AAV-PAN | 导管注射 / 腹腔注射 / 尾静脉注射 |
| 脂肪 | AAV9 | 腹腔注射（腹内脂肪）/ 原位注射（皮下脂肪） |
| 肠道 | AAV9 / AAV1 / AAV5 / AAV8 / AAV2 | 肠系膜注射 / 灌肠 / 腹腔注射 |
| 血管（内皮为主） | AAV9 / AAV1 / AAV5 / AAV-VEC / AAV-eVEC / AAV-VEC2 | 腹主动脉局部孵育 / 尾静脉注射 |
| 内耳 | AAV-ie / AAV-anc80L | 圆窗膜注射 / 后半规管注射 |
| 皮肤 | AAV9 | 皮内注射 / 皮下注射 / 滚针 / 涂抹 |
| 膀胱 | AAV-BLS | 膀胱内注射 / 逼尿肌注射 |
| 关节软骨 / 骨组织 | AAV-DSS-NTER / AAV9 | 关节腔注射 / 骨髓腔注射 / 尾静脉注射 |
| T 细胞 | AAV-Ark313 | 静脉注射 |
血清型决定病毒更容易进入哪些组织或细胞，属于物理递送层面的效率。若要将表达限定在特定细胞类型，需依赖组织特异性启动子或 Cre 依赖的表达系统。两者可独立选择并叠加使用。
启动子决定目的基因进入细胞后在哪些细胞中表达。使用组织特异性启动子可将表达限定于目标细胞类型，减少非目标细胞中的编辑。研究特定细胞类型中的基因功能时，该步骤尤为关键。
| 组织 | 常用特异性启动子 |
|---|---|
| 神经 | hSyn、mecp2、TUBA1A、CaMKII、hVGAT、TH、gfaABC1D（星形胶质细胞）、iba1 / CX3CR1 / TMEM119（小胶质细胞）、CNP / MBP / PLP（少突胶质细胞） |
| 心脏 | cTNT（心肌细胞）、POSTN / COL1A2 / TCF21（心肌成纤维细胞）、ANF（心房） |
| 肌肉 | MHCK7、ACTA1（Spc5-12）、MYOG、SM22a（平滑肌）、TCF4 |
| 肝脏 | TBG、ALB、Apoe、Hlp（人源肝脏）、LRAT（肝星状细胞）、OIT3（肝窦内皮） |
| 肺 | SP-C（SFTPC） |
| 肾脏 | nphs1 / nphs2（足细胞）、Ksp-cadherin、SGLT2、Ggt1 |
| 胰腺 / 肠道 | PDX1、Insulin2、Villin |
| 脂肪 | FABP4（aP2）、adiponectin、UCP1（棕色脂肪）、Myf5 |
| 内皮 / 免疫 | TIE1、TIE2、CDH5、ICAM2、F4/80（巨噬细胞）、lyve1 / PROX1（淋巴内皮） |
| 视网膜 / 其他 | rpe65、Arr3、RLBP1、Keratin14（皮肤）、COL2A1（软骨）、TERT（肿瘤） |
AAV给药途径与血清型需联合选择。尾静脉、局部注射、脑立体定位、鞘内、玻璃体腔、滴鼻雾化等不同途径对应的组织分布差异显著。
全身性递送，肝脏、心脏、肌肉分布好，操作最简单。
绕开血脑屏障做局部脑区，需要手术操作。
主要用于脊髓与背根神经节。
心肌、骨骼肌原位注射，用量小、局部浓度高。
眼科相关研究，视网膜下腔或玻璃体腔注射。
肺脏递送，经气道吸入或滴注。
AAV 介导的表达起效慢，标准单链 AAV 进入细胞后需完成第二链合成，峰值表达通常需 3 周左右，取样过早可能无法观察到编辑效果。具体时长与血清型、启动子、给药剂量相关，详见腺相关病毒操作手册。
根据客户的目标组织确定血清型，并按目标细胞类型确定启动子，制定AAV载体方案。
按 SaCas9 的 NNGRRT（KKH 为 NNNRRT）筛选靶点，不沿用 SpCas9 设计；Cas9+gRNA单载体 all-in-one，表达盒 ≤ 4.4 kb。
完成 AAV 包装与纯化，以 qPCR 法测定病毒滴度，交付标准 ≥1012 v.g/mL或 ≥1013v.g/mL。具体以合同为准。
交按约定体积与滴度交付纯化 AAV 病毒液，随附 T 载体测序报告与滴度检测报告。
动物注射与取样由客户自行完成或委托。给药后约 3 周进入峰值表达，取样时间需预留。
| 项目 | 检测方式 | 说明 |
|---|---|---|
| 纯化 AAV 病毒液 | 按约定体积与滴度交付 | 纯度满足在体使用要求 |
| 滴度测定报告 | qPCR，≥1012v.g/ml | 明确测定方法与结果 |
| 载体测序报告 | Sanger 测序 | 确认 SaCas9 与 sgRNA 序列正确 |
AAV-SaCas9助力阿尔茨海默症神经保护机制研究
Oral GLP-1 receptor agonist promotes astrocyte-neuron lactate and lipid transfer with neuroprotective effects
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