体外细胞水平 CRISPR/Cas9 基因编辑服务

Cas9 负责切，sgRNA 负责带路。sgRNA 与靶序列配对之后，Cas9 在那个位点把 DNA 双链切开，细胞用 NHEJ 缝合时经常多出或少掉几个碱基，编码区一旦移码，基因就失活了。

敲除这一步，各家做法都一样。真正决定成败的是怎么把这套系统送进细胞。

三条路。质粒靠转染，慢病毒和腺病毒靠感染。

已经熟的就跳过，直接看 03 怎么选递送工具。这里只讲一次敲除到底发生了什么。

靶位点切开后产生插入或缺失，编码区移码导致功能丧失。最成熟的一类，也是做得多的一类。

分别设计各基因的 gRNA 同时转染，或者先建一株 Cas9 稳转细胞再逐个转入 gRNA。基因数量越多越难，筛选策略要在方案阶段定下来。

dCas9 融合激活或抑制元件，DNA 序列不动，只调转录水平。研究必需基因、需要可逆调控时用。

lncRNA、miRNA、circRNA 的策略和编码基因不一样，要看转录本结构和剪接位点，单独评估。

不想自己操作、只想拿到结果，直接看 单克隆基因敲除细胞株。

选之前先回答三个问题。

常规细胞系（HEK293T、HeLa 这类）转染效率够用，质粒就行。原代细胞、悬浮细胞、神经元、免疫细胞基本转不进去，得靠病毒感染。

要长期稳定表达，走慢病毒。后续要测序、希望基因组保持干净，走腺病毒或质粒。

短期一次性实验用质粒，瞬时表达，几天后就衰减。要持续表达用慢病毒。要短期高强度表达用腺病毒。

滴度范围、纯度标准这些具体数值按实际 SOP 交付，见 08 交付标准。

细胞转染效率高、只做短期表达、或者后续要自己包装病毒。质粒省掉了病毒包装和滴度测定两步，周期最短，也不涉及病毒操作的备案要求。

• sgRNA 表达载体，U6 等 Pol III 启动子驱动。每个靶基因建议设计 3 到 4 条并联筛选，单条效率低是返工最常见的原因。
• Cas9 表达质粒，SpCas9 常规形式，或带筛选标记、荧光标签的融合形式，比如 pSpCas9(BB)-2A-EGFP/PURO，同时带 EGFP 和嘌呤霉素抗性，转染后可以直接药筛或流式富集。
• All-in-one 质粒，sgRNA 和 Cas9 在同一个载体上，一次转染完成导入。
• Cas9n 双切口与 dCas9 系统，前者降脱靶，后者做表达调控。

• 启动子，sgRNA 常用 U6 这类 Pol III，Cas9 常用 CBh、EFS、EF1a 这类 Pol II。不是越强越好，强度影响表达量，也影响脱靶概率。
• 标记，抗性基因（Puro / Bsd / Neo）用来药筛富集，荧光蛋白（EGFP / mCherry）用来看转染效率和分选。转染效率低的细胞，带标记能省很多事。
• 单载体还是双载体，All-in-one 简单，适合高效转染的细胞；分装方案在后续病毒包装上更灵活。

质粒靠转染，难转染的细胞基本没戏，表达也是瞬时衰减。这两类需求看 慢病毒 或 腺病毒。

细胞转不进去、要长期稳定表达、要建稳转株、要做 sgRNA 文库筛选。这几种情况基本只能选它。

慢病毒靠感染进入细胞，绕开了转染这一步，可编辑的细胞范围一下就宽了，原代细胞、悬浮细胞、神经元、免疫细胞都在里面。我们做敲除细胞株用的也是这套。

• sgRNA 慢病毒，感染已经稳定表达 Cas9 的细胞系。片段小、滴度高，文库筛选和多靶点并行的常规选择。
• Cas9 慢病毒，先建 Cas9 稳转株再转入 sgRNA，适合反复换靶点的课题组。
• All-in-one 慢病毒，一次感染完成系统导入，操作最省事。
• 可诱导、条件性表达系统，需要控制编辑发生时点时用，避免持续表达累积脱靶。
• sgRNA 文库慢病毒，按项目规模包装，重点看滴度和文库覆盖度。

载体自带抗性或荧光标记的话，感染后直接药筛富集，再用有限稀释法挑单克隆，就能拿到基因型一致的敲除细胞株，见 单克隆基因敲除细胞株。滴度定义、保存条件这些通用参数在 慢病毒包装服务。

代价是整合。外源序列会插进宿主基因组，长期表达是好处，插入风险也得认。不想改基因组，看腺病毒。

不想让外源序列整合进基因组，又要高效感染原代细胞，或者要在有限时间窗口里做高强度敲除。

• 基因组保持干净，腺病毒以游离体形式待在细胞核里，不往基因组上插。后续要测序、不想引入插入突变的实验，这一点是决定性的。
• 原代细胞也能打进去，感染效率普遍高于质粒转染，载体容量还比 AAV 大，装 SpCas9 全长没有压力。
• 表达强但衰减快，编辑窗口集中在前一段，之后慢慢掉。要长期稳定表达请回头看慢病毒。

腺病毒既能感染体外细胞，也能通过尾静脉给药做动物在体编辑。但在体对病毒纯度和内毒素的要求比体外高得多，方案阶段就得说清用途。要长期、组织特异性的在体编辑，AAV-saCas9 更合适。免疫原性和通用技术参数见 腺病毒包装服务。

三种递送方式共用一套流程，差别只在第 4 步。

• 质粒，制备转染级质粒，按方案转染。
• 慢病毒，包装、测滴度、感染靶细胞后药筛富集。第一次合作的细胞系建议先做感染预实验定 MOI。
• 腺病毒，包装纯化、测滴度、感染或按方案给药。在体还要先明确给药途径和目标组织。

第 2 步给出设计报告供确认，第 5 步用 T 载体测序看突变类型，序列变化能直接读到。

腺病毒做动物在体，纯化和内毒素控制的要求比体外高一档，需求阶段说清用途，按对应标准生产。

同样是「基因敲除」四个字，用质粒还是病毒、做混合克隆还是单克隆、要不要加脱靶分析，工作量能差好几倍。所以没有统一标价，确认需求后给书面报价。

2. 递送方式，质粒构建、慢病毒包装、腺病毒包装、AAV 包装、单克隆细胞株，复杂度依次上升。
4. 靶基因和 sgRNA 数量，单靶点、双靶点、双切口 nickase、多基因、文库，各不一样。
6. 细胞难度，常规贴壁细胞系、悬浮细胞、原代细胞、干细胞、难转染细胞，成本差距明显。
8. 附加验证，WB、qPCR、T 载体测序、STR 鉴定、脱靶分析、功能学检测。
10. 交付规模和周期，质粒量、病毒滴度与体积、克隆数量，加急与否。

把靶基因、物种、细胞系、预期用途四项发过来，就能拿到含方案、周期和费用的书面报价。

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