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CRISPR/Cas9基因敲除服务

CRISPR/Cas9 Service

CRISPR-Cas9系统是基于原核生物适应性免疫机制改造的基因编辑技术。其包含两个模块,一是识别特异DNA序列的gRNA及其骨架,二是结合和编辑DNA的蛋白质Cas9。自被发明以来,该技术快速发展,目前CRISPR-Cas9及其变体已经被广泛应用于活细胞内核酸的编辑、检测、标记、成像等各个领域。由于其在不同物种中所展示出的高效易用的特点,该技术已经革新了基础生命科学和生物医学的研究方式。该技术的发明人也被授予了2020年诺贝尔化学奖。如今CRISPR-Cas系统仍在蓬勃发展,无论在基础科学研究领域还是在基因治疗、细胞治疗等临床应用领域都具有广泛的前景和深厚的潜力。

汉恒生物作为基因敲除技术服务公司,提供CRISPR/Cas9基因递送工具,如果您需要了解更多CRISPR/Cas9技术原理与应用,可以前往干货文章《CRISPR-Cas原理与工具,一文了解基因编辑魔剪CRISPR-Cas9系统》了解更多。

产品及服务:
产品分类 产品名称 功能介绍
CRISPR/Cas9质粒 pSpCas9(BB)-2A-EGFP/PURO 瞬时转染,低转染效率
CRISPR/Cas9慢病毒
Lentivirual vector-mediated spCas9 system 整合基因组,有脱靶潜在风险
CRISPR/Cas9腺病毒
Adenoviral vector-mediated spCas9 system  非整合,高效细胞KO体系
CRISPR/Cas9腺相关病毒
AAV-saCas9           

在体基因编辑利器

CRISPR/Cas9质粒/病毒载体构建

Knockout / Knockin plasmid and virus construction

敲除细胞株 单克隆敲除细胞株(编码基因、非编码基因)
特异性腺相关病毒 组织特异性表达Cas9的各种病毒

CRISPR/Cas9简介:

CRISPR/Cas 系统全称为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。这一系统是源于细菌中的一种后天免疫系统(图1)。该系统可以把侵入细菌的噬菌体遗传物质整合到自身基因组一个或者多个CRISPR位点作为永久的“记忆”,当细菌被再次入侵的时候,CRISPR 位点被转录生成 CRISPR RNAs(crRNAs)。crRNA 随后会引导 DNA剪切酶 Cas9 根据序列互补的原则剪切入侵的外源核酸序列,消灭外来遗传物质,发挥保护功能(图2)。简而言之,源于 CRISPR/Cas 系统的基因组编辑技术被工程化为一段介导定位作用的 RNA 序列(guide RNA和crRNA合二为一的杂合RNA序列,称为sgRNA)加上一个DNA水解酶Cas9组成的二元系统。

研究者把这一系统工程化成可以用于编辑哺乳动物细胞的CRISPR/Cas9系统。具体包括适于哺乳动物表达的 Cas9 基因和定位作用的 sgRNA(图3)。方便起见,研究者把这两者放在了一个载体之中(all in one plasmid)。如果计划利用这一系统编辑某个目的基因,我们唯一要做的就是定制一条有效的sgRNA。


图1  CRISPR/Cas 系统来源于细菌的“免疫系统”


图2 细菌利用 CRISPR/Cas 系统攻击噬菌体入侵示意图


图3 工程化的 CRISPR/Cas 系统。该系统是个二元系统:负责切割的 Cas9 核酸酶和定位用的 guide RNA (sgRNA)

常见问题
Crispr/Cas9基因敲除和RNAi干扰的对比

1)从抑制基因表达的效率上来讲,RNAi是在转录后水平降低基因表达,而Crispr/Cas9则可以靶向DNA并永久改变或敲除基因表达。有些时候可能需要Crispr/Cas9来完全敲除,以免残留的低水平蛋白表达造成任何不确定的影响。例如在癌细胞中,某些基因有多个转录本的情况下,这种完全敲除就很有效。当然,在某些情况下敲低可能是更好的选择。例如,某些基因是细胞生长所必需的,完全敲除会造成细胞致死,导致基因功能难以研究,相比之下敲低则可以更好地模拟药物对靶点的抑制。

2)从脱靶效应上来讲,RNAi和Crispr/Cas9都有脱靶效应的风险。因为shRNA或sgRNA均可靶向带有互补种子区的序列,造成依赖序列的脱靶效应。此外,RNA还表现出不依赖序列的脱靶活性。两者相比,由于CRISPR系统必须在转录起始位点附近才能发挥作用,其脱靶效率要远低于RNAi。

3)从操作的难易程度上来讲,Crispr/Cas9需要将Cas9和sgRNA一起导入细胞,而RNAi则不需要另外的蛋白因子,转染相对比较快速简单,能够迅速引起表型变化。

多基因敲除怎么设计?

需要针对两个基因分别设计gRNA。可同时进行细胞转染。也可以先做一个Cas9的细胞株,然后再将不同基因的gRNA转进去。

应用实例:

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汉恒合作发表的基因编辑论文:AAV-SaCas9在肌肉组织中在体编辑目的基因。


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中国药科大学客户使用汉恒构建的pHBcas9/ gRNA puro vector成功建立了SCAP基因敲除的HL-7702细胞株。



温州医科大学附属第二医院客户使用汉恒生物生产的CRISPR-Cas9慢病毒成功建立了NSUN2敲除的BGC-823细胞株。



武汉华中农业大学生物医学中心兽医学院客户使用汉恒生产的CRISPR-Cas9腺病毒通过尾静脉注射感染小鼠肝脏,成功对目的基因进行了编辑。

客户发表文献节选:
Anterior cingulate cortex dysfunction underlies social deficits in Shank3 mutant mice
(杂志:Nature Neuroscience,IF=21.126,西安第四军医大学基础医学院神经生物学系)
SLE non-coding genetic risk variant determines the epigenetic dysfunction of an immune cell specific enhancer that controls disease-critical microRNA expression
(杂志:Nature communications,IF=14.919,上海交通大学医学院附属仁济医院上海风湿研究所)
Discovery of a potent SCAP degrader that ameliorates HFD-induced obesity, hyperlipidemia and insulin resistance via an autophagyindependent lysosomal pathway
(杂志:Autophagy,IF=11.059,中国药科大学)
Prevention of Muscle Wasting by CRISPR/Cas9-mediated Disruption of Myostatin In Vivo
(杂志:MOLECULAR THERAPY,IF=8.986,中科院营养所/汉恒研究中心)
NSUN2 modified by SUMO-2/3 promotes gastric cancer progression and regulates mRNA m5C methylation
(杂志:Cell death & disease,IF=8.469,温州医科大学附属第二医院)
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