棕色脂肪组织（BAT）是非颤抖产热（NST）的主要部位，NST可保护哺乳动物免受低温的伤害。NST在动物暴露于寒冷环境时显著增加，并由BAT内的线粒体解偶联介导，释放能量以产生热量。为了补充细胞内的能量储备，冷激活的BAT需要增加葡萄糖和脂肪酸的摄取作为燃料供应以维持高水平的线粒体呼吸。然而，在这种体温调节的挑战下，BAT控制血糖稳态的内分泌功能知之甚少。

2023年9月6日，南京大学张辰宇教授团队和剑桥大学Antonio Vidal-Puig教授团队合作在《nature communications》（IF=17.694）发表了题为“Cold-activated brown fat-derived extracellular vesicle-miR-378a-3p stimulates hepatic gluconeogenesis in male mice”的研究论文，在此文章中，研究者们展示了在雄性小鼠中，BAT来源的细胞外囊泡（BDEVs）在冷应激期间通过促进肝脏糖异生来重新编程系统的葡萄糖代谢。冷暴露有助于miR-378a-3p（一种大量存在于BAT中的miRNA）选择性包装到细胞外囊泡（EVs）中并递送到肝脏中，通过靶向p110α促进糖异生。总之，作者证明了由寒冷诱导的含有miR-378a-3p的BDEV可以作为内分泌信号分子在冷应激下调节肝脏糖异生。值得注意的是，本文使用的分别特异性过表达或敲低BAT和肝脏中miR-378a-3p的AAV来自汉恒生物。

接下来，我们来看看研究结果：

首先，为了确定在寒冷环境下BAT是否刺激肝脏糖异生，作者将小鼠置于4℃环境下，小鼠体温在早期下降，一段时间后，小鼠迅速适应，体温恢复到对照水平，表明产热的激活，且UCP1等相关产热基因的表达显著升高，此外，寒冷显著刺激了小鼠每日的食物摄入，同时体重降低，表明提高了代谢率以抵御寒冷。冷激活的BAT中，2-NBDG显著升高以及更多的葡萄糖转运蛋白FLUT4易位到质膜，说明冷暴露增加了BAT中的葡萄糖摄取，QPCR结果显示，冷暴露的小鼠肝脏中的糖异生增加，AKT、FOXO1和GSK3β的磷酸化在肝脏中的冷暴露受到明显抑制，表明冷暴露对BAT（葡萄糖摄取增加）和肝脏（糖异生增加）的葡萄糖代谢有协调作用。为了测试冷暴露对肝脏葡萄糖代谢的影响是否会直接受到BAT的影响，作者从小鼠身上切除了肩胛骨间棕色脂肪组织（iBAT），与假手术组相比，切除iBAT的小鼠早期的体温下降更迅速，适应温度变得相对更慢，且iBAT切除没有改变食物摄入量，同时糖异生基因表达水平降低，AKT、FOXO1和GSK3β的磷酸化明显增加。综上所述，冷激活的BAT可能促进肝糖异生来直接影响肝糖代谢。

图1. BAT在冷暴露时刺激肝脏糖异生

由于有证据表明BAT还有内分泌器官的功能，所以作者探究了BAT分泌的细胞外囊泡（EVs）是否也可能在这过程中发挥作用。作者将小鼠分别置于25℃（RT-BAT）和4℃（Cold-BAT）环境下，72h后分离BAT来源的EVs，分析显示，Cold-BAT通常比RT-BAT表现出更多的EVs分泌，此外，EVs的标志基因的表达在Cold-BAT分泌的EVs中显著增加。随后，通过对BDEVs的可视化和追踪，作者在体外和体内分别验证了冷暴露促进BDEVs的分泌并促进其输送到肝脏。随后，作者又探究了冷激活的BAT分泌的EVs是否可以作为内分泌调节剂来调节肝糖代谢，作者分别将RT-BDEVs和Cold-BDEVs和原代肝细胞孵育48h，然后进行功能分析，与用RT-BDEVs孵育的细胞相比，用Cold-BDEVs孵育的细胞AKT的磷酸化水平显著降低，同时糖异生基因的表达（Pgc-1α、G6Pase、Pepck）显著增加。将RT-BDEVs和Cold-BDEVs静脉注射到正常饲养的小鼠体内，与RT-BDEVs组相比，Cold-BDEVs处理导致糖异生基因表达水平升高，磷酸化AKT，FOXO1和GSK3β水平降低，丙酮酸转化为葡萄糖的量增加。为了验证Cold-BDEVs在调节糖异生方面的关键作用，作者使用EV分泌抑制剂GW4869阻断寒冷诱导的BDEVs产生，在GW4869处理后，在小鼠肝脏中观察到磷酸化AKT增加和糖异生基因减少。综上说明冷刺激产生的BDEVs可以促进肝糖异生。

图2. Cold-BDEVs增强了肝糖异生

越来越多的证据表明，细胞来源的EV含有许多miRNA，这些包装在EV中的miRNA可以被受体细胞吸收以调节其功能，所以作者探究了BDEVs中是否也含有有助于寒冷诱导的肝糖异生的功能性miRNA。通过测序以及QPCR验证，miR-378a-3p和miR-193b-3p被选为候选miRNA，然而，只有miR-378a-3p在暴露于寒冷的小鼠的BDEVs和血清EV中显著上调，这表明miRNA被选择性地包装在活化的BDEVs中，因此，作者选择了miR-378a-3p进行进一步研究。QPCR显示，miR-378a-3p在冷暴露的小鼠iBAT中表达水平显著升高。静脉注射Cold-BDEVs的小鼠相比于注射RT-BDEVs的小鼠，miR-378a-3p的肝脏表达量升高更显著，而在BAT中局部注射GW4869导致冷暴露的小鼠肝脏中miR-378a-3p水平显著降低。此外，与对照组相比，BAT切除的小鼠在冷暴露后血清EVs和肝脏中表现出显著较低的miR-378a-3p表达水平。这些结果表明，冷暴露时，BDEVs将miR-378a-3p输送到肝脏中，导致肝脏miR-378a-3p升高。

图3. 冷暴露会增加BDEVs中miR-378a-3p的表达

接下来，作者研究了miR-378a-3p在调节肝细胞葡萄糖代谢中的作用。用miR-378a-3p的模拟物转染原代棕色脂肪细胞，收集BDEVs并与肝细胞一起孵育。与对照细胞相比，miR-378a-3p的过表达显著诱导肝细胞中葡萄糖的产生，同时糖异生基因表达上调，肝细胞中p-AKT、p-FOXO1和p-GSK3β的蛋白质水平降低。p110α是控制葡萄糖代谢的PI3K激酶的基本亚基，在先前的研究中被证明是miR-378a-3p的直接靶标。WB结果显示，miR-378a-3p过表达显著降低了肝细胞中p110α的蛋白水平，但没有显著改变总胰岛素受体（IR）表达水平和IR的磷酸化水平。相反，用miR-378a-3p抑制剂处理肝细胞，发现p110α的蛋白水平升高，糖异生基因的表达下调。这些结果表明，BDEVs中的miR-378a-3p是促进肝细胞糖异生的重要信号分子。

然后，作者评估了含有miR-378a-3p的BDEVs在体内环境中的作用。为了实现iBAT中miR-378a-3p的特异性过表达，作者使用了汉恒生物提供的FABP4特异性启动子启动的miR-378a-3p过表达AAV病毒（AAVFABP4-378a），通过原位多点注射，在感染病毒后28天，检测到iBAT中miR-378a-3p的表达显著增加，与对照组相比，过表达组的小鼠的血清EV和肝脏中miR-378a-3p的表达水平也增加，肝脏糖异生增加，同时p-AKT和p110α信号传导降低，而总IR表达水平和IR的磷酸化水平不变，证实miR-378a-3p通过靶向肝脏中的p110α直接影响IR下游的因子。总之，这些数据证实了含有miR-378a-3p的BDEVs可以通过在体内直接靶向肝脏p110α来促进糖异生。

图4. miR-378a-3p在BAT中的过表达调节小鼠肝糖异生

为了研究miR-378a-3p在冷暴露期间调节葡萄糖稳态中的作用，作者使用CRISPR/Cas9系统生成了miR-378a-KO小鼠模型（378KO），在RT条件下饲养的378KO小鼠的肝脏中检测到p110α蛋白水平增加，但没有检测到体重或食物摄入的显著变化，而血糖水平略有下降，而在冷暴露的378KO小鼠的肝脏中观察到AKT磷酸化显著增加，Pgc-1α、G6Pase和Pepck表达降低，表明冷诱导的肝脏糖异生受损。随后作者利用AAVFABP4-378a通过多点注射恢复iBAT中的miR-378a-3p水平。miR-378a-3p在iBAT中的重新表达显著升高了378KO小鼠肝脏中的G6Pase和Pepck，进一步证实了BAT来源的miR-378a-3p直接促进肝脏糖异生。

图5. iBAT中miR-378a-3p的恢复挽救了miR-378 KO小鼠的肝糖异生

为了具体研究miR-378a-3p对寒冷诱导的肝糖异生的影响，作者使用了肝脏特异性启动子启动表达miR-378a-3p反义序列的AAV病毒（AAVTBG-sponge），尾静脉注射到小鼠体内，在感染后25天，将小鼠置于寒冷环境中72h，肝脏中miR-378a-3p的敲低导致p110α和p-AKT的蛋白质水平显著增加，同时G6Pase和Pepck，Pgc-1α的表达降低。为了直接证明iBAT中miR-378a-3p的特异性下调是否会影响寒冷诱导的肝糖异生，作者将AAVFABP4-sponge注射到iBAT中，感染后25天，小鼠在处死前冷暴露3天，发现与对照组相比，感染AAVFABP4-sponge的小鼠BDEVs、血清EV和肝脏中的miR-378a-3p表达降低，而肝脏中miR-378a-3p的转录不受影响，表明BAT中miR-378a-3p下调导致分泌到肝脏中的miR-378-3p减少，而且iBAT中miR-378a的敲低增加了肝脏中p110α和p-AKT的蛋白质水平，并抑制了肝脏糖异生基因的表达。

图6. BAT中miR-378a-3p的下调抑制了寒冷诱导的肝糖异生

综上所述，本研究表明，由寒冷激活的棕色脂肪分泌的富含miR-378a-3p的胞外囊泡刺激肝脏葡萄糖的产生，以维持全身葡萄糖稳态。研究结果通过确定BDEVs中miR-378a-3p 在冷应激下调节肝糖代谢的作用，强调了BAT冷应激下的内分泌功能。

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