引物设计原则

引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。可以借助在线的设计工具辅助引物的设计，如primer 3.0或者primer-blast优化引物，引物优化主要考虑以下原则：

碱基组成，G+C含量应为40%～60%，4种核苷酸在引物上均匀分布，避开富含GC区。

1、长度，引物的长度为18~30nt，一对引物的长度差别不要大于3个碱基。

2、内部重复及自互补结构，确保引物不含有反向重复序列或>3bp 的自互补序列。

3、引物间的互补，一条引物的3'端不能和另外一条引物的任何区域配对。

4、溶解温度（Tm），引物和靶序列形成的二聚物的最佳Tm介于55~60℃，同一PCR中的两条引物的T差距不能超过3℃。

Tm=2℃(A+T)+4℃ (G+C)

5、GC夹，引物3'端以G结尾有利于提高引物的效率和特异性，但是，最后5个碱基中应避免超过3个G或C。

6、防止序列错配，引物序列需要对靶标序列进行BLAST 比较，以寻找可能的错配导致非特异性扩增水平的提升。

在不同的克隆方式中，引物要根据需求进行适当调整，下面分别介绍：

TA克隆引物设计

TA克隆是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点中，这种构建方法不依赖限制性内切酶。

在已知序列的TA克隆中，只需在目的序列的5’端和3’端提取适当长度的序列作为引物即可。

酶切连接引物设计

在酶切连接法中，我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。在设计酶切连接的引物时，除了要遵循上述TA克隆的引物设计原则外，还在要引物中添加酶切位点和保护性碱基。添加酶切位点需要注意:

1、酶切位点选择：（1）选择常用酶，（2）目的片段中不存在的酶切位点，（3）目的载体多克隆位中的酶切位点

2、添加保护碱基，需要考虑两个因素，即碱基数目和碱基种类。碱基数目在内切酶的供应商都是有数据参考的。碱基数目可以根据两条引物的Tm值和碱基分布及GC含量进行调整。

同源重组引物设计

同源重组技术的克隆技术不需要对插入片段进行酶切消化，无需考虑片段上的酶切位点，而且能是实现多片段、快速，高阳性率的定向克隆。

插入片段需要有和载体相同的末端序列（同源臂序列），因此在需要通过pcr扩增方法在目的片段两端添加同源臂序列，同源重组引物由两部分组成：基因特异性引物序列和同源臂序列。基因特异性引物设计方法与TA克隆中的设计方法一致，同源臂部分需要与线性化载体两端的序列相一致，一般长度为15-25bp，实际长度可以根据TA克隆引物设计中所述各项原则进行优化调整。