IF=27.7丨肿瘤治疗的新希望——PD-L1/VEGFR2双特异性纳米抗体FAP1V2

癌症治疗失败主要源于两大障碍：肿瘤的耐药性与转移。一方面，癌细胞通过多种耐药机制导致药物治疗效果显著降低；另一方面，免疫细胞功能异常，特别是T细胞在肿瘤微环境中发生耗竭，表现为功能受损和增殖能力下降，从而无法有效清除肿瘤细胞。此外，肿瘤组织中细胞毒性免疫细胞浸润数量的减少，也削弱了免疫系统对肿瘤的攻击能力。为同时克服药物治疗无效和免疫反应不足这两大难题，研究人员正在致力于开发靶向PD-L1和VEGFR2的双特异性纳米抗体。

汉恒生物为本研究提供了LipoFiter™ 3转染试剂，保障了实验的顺利推进。2025年4月19日，中国科学院福建物质结构研究所陈卓研究员与张蕾研究员在Molecular Cancer（IF=27.7）上发表题为“Transient intracellular expression of PD-L1 and VEGFR2 bispecific nanobody in cancer cells inspires long-term T cell activation and infiltration to combat tumor and inhibit cancer metastasis”的研究论文。该研究成功开发出一种同时靶向PD-L1和VEGFR2的双特异性纳米抗体FAP1V2，该分子不仅能有效抑制肿瘤生长与转移，还可增强T细胞介导的免疫应答，为肿瘤免疫治疗提供了新的潜在策略。

下面，我们一起来看看具体的研究内容。

研究成果

1.FAP1V2纳米抗体结合PD-L1与VEGFR2的结构基础源于其VH区设计FAP1V2

序列依次包含IL-2信号肽、抗PD-L1 VH区（AP1）、(GGGGS)3连接子、EGFP片段、(GGGGS)3连接子、抗VEGFR2 VH区（AV2）以及C端的GPI锚定序列（图1A）。GPI锚定肽能够将FAP1V2稳定表达于细胞膜表面，从而促进其与PD-L1和VEGFR2的膜上结合。此外，作者还构建了对照质粒pEGFP-C1-AP1（FAP1，仅含AP1序列）和pEGFP-C1-AV2（FAV2，仅含AV2序列），以便进行比较。为进一步评估FAP1V2与两种靶标蛋白的结合潜力，研究团队进行了计算机模拟与分子对接分析。结果显示，FAP1V2分别与PD-L1和VEGFR2之间可形成特异的氢键和静电相互作用，从结构层面支持了其双特异性结合能力。

图1 复合物FAP1V2/PD-L1及FAP1V2/VEGFR2的胞内抗体设计及分子对接

>2.FAP1V2 在细胞中的表达与靶标特异性

为评估FAP1V2的功能，本研究选用了人宫颈癌细胞HeLa和小鼠Lewis肺癌细胞LLC两种模型细胞系：HeLa常用于体外实验，LLC则适用于荷瘤小鼠中的免疫相关研究。将携带FAP1V2基因的质粒转染至HeLa细胞后，通过PCR等技术验证了该质粒的成功表达。Co-IP实验进一步证实，FAP1V2能够特异性结合PD-L1和VEGFR2。流式细胞术与共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析结果显示，FAP1V2可显著抑制细胞表面PD-L1或VEGFR2与商品化RBITC标记对应抗体之间的结合，从而有效阻断PD-L1/PD-1信号通路。

图2 FAP1V2特异性结合PD-L1和VEGFR2可有效抑制肿瘤进展

3.FAP1V2抑制PD-L1/PD-1检查点并增强体内T细胞介导的抗肿瘤免疫

基于小鼠模型的肿瘤抑制实验显示，表达FAP1V2的LLC细胞能够显著抑制肿瘤生长。相比之下，FAP1组抑制效果较弱，而FAV2组呈现中等程度的效果。

图3 FAP1V2介导PD-1检查点阻断免疫抑制在小鼠模型中的疗效

通过免疫荧光分析肿瘤组织中TCRβhi T细胞和PD-1hi免疫细胞的浸润情况，发现FAP1、FAV2和FAP1V2处理组中，TCRβhi T细胞浸润均有所增加，肿瘤细胞清除增强，PD-1hi免疫细胞数量下降，其中FAP1V2组效果最为显著。此外，由于CD25（IL-2Rα）在活化T细胞中高表达，作者进一步分析了小鼠脾脏中CD25hi T细胞的比例。流式细胞术结果显示，在所有胞内抗体表达组中，CD25hi免疫细胞数量均有所上升，尤其在FAP1V2和FAP1组中增长最为明显，表明其有效增强了免疫应答。

图4 体内诱导的针对LLC肿瘤的免疫系统激活

4.FAP1V2和FAV2抑制癌细胞迁移

细胞活力实验表明，FAP1、FAV2和FAP1V2对肿瘤细胞活力均无显著影响。然而，划痕实验结果显示，FAP1V2和FAV2可明显抑制HeLa与LLC细胞的迁移能力。进一步的体内实验也证实，FAP1V2能够有效减少LLC细胞在肝脏和肺组织中的转移。这些结果表明，FAP1V2主要通过阻断VEGFR2信号从而抑制癌细胞的迁移和转移。

图5 FAP1V2对癌细胞迁移能力的影响

5.FAP1V2介导的HeLa细胞差异基因表达

GO分析显示，FAP1V2处理的HeLa细胞中，与细胞迁移、粘附、组织发育、增殖、分化和免疫系统过程相关的基因表达发生显著改变。关键差异基因富集于Wnt/β-catenin、ERK1/2、TNFβ、PI3K/AKT和mTOR等信号通路。此外，一些促进癌细胞迁移的基因（如MET、PIK3CA）转录水平下调，而抑制迁移的基因（如PCDHs、UCN）则表达上调。

图6 HeLa-FAP1V2细胞转录组分析

综上所述，本研究成功开发了一种新型双特异性VH结构域胞内抗体FAP1V2，能够同时靶向PD-L1和VEGFR2。该分子通过阻断PD-1/PD-L1免疫检查点并抑制肿瘤转移相关信号通路，显著增强TCRβhi T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，并有效抑制肿瘤转移。转录组分析进一步揭示，FAP1V2可调控Wnt/β-catenin、TGF-β1和PI3K/AKT等重要信号通路，上调抑癌基因（如PCDHs、UCN），同时下调促转移因子（如MET、PI3K 110α），从而发挥双重抗肿瘤效应。基于FAP1V2所构建的AP1V2-NP递送系统进一步提升了治疗效果，为肿瘤免疫治疗策略及胞内抗体的应用提供了新思路。