细胞焦亡系列【2】炎症小体

2.NLRP3炎症小体

NLRP3炎症小体是研究较深入的一类蛋白复合体，也是迄今为止发现配体数最多、最复杂的一种炎症小体，由三个主要蛋白质成分组成：NLRP3、ASC和caspase-1。NLRP3是一种三联蛋白，主要包括三个结构域：N端的PYD结构域负责介导下游信号的传输；中央NACHT结构域具有ATP酶活性，驱动受体激活过程中的寡聚化；C端的LRR结构域能识别相应病原体或危险信号进而启动NLRP3炎症复合体的组装，在配体识别中起重要作用[15]。

通常情况下，NLRP3作为传感器响应各类刺激，通过同型NACHT结构域相互作用实现自寡聚化，寡聚化的NLRP3通过PYD-PYD结构域相互作用募集ASC，并诱导ASC聚集形成“ASC斑点”。组装的ASC通过CARD-CARD相互作用募集pro-caspase-1，形成NLRP3-ASC-caspase-1蛋白复合物，导致pro-caspase-1自裂解激活及IL-1β前体蛋白水解加工和成熟。活化的caspase-1还裂解gasdermin D（GSDMD）并释放其N端结构域，该结构域转移至细胞膜并形成孔道，介导包括炎性细胞因子IL-1β和IL-18等细胞内容物的释放，并诱发细胞焦亡[16]。

NLRP3炎症小体的激活包括经典、非经典路径和替代路径。经典的激活路径可以分为两个阶段：启动阶段（信号1）和激活阶段（信号2）。启动阶段由模式识别受体介导信号激活，相应PRR识别PAMP或DAMP（如LPS和TNF-α）后，可进而通过NF-kB信号上调NLRP3、IL-1b等炎症小体组分的转录表达[17,18]。激活阶段NLRP3炎症小体由多种结构、功能不同的激动剂诱发，从无活性的同源多聚体转变为活性多聚炎性体，但目前并没有研究证据表明NLRP3直接结合这些激动剂。激动剂包括晶体或颗粒物质（β-淀粉样蛋白、硅石、尿酸盐晶体等）、生物信号（线粒体活性氧、细胞外ATP等）、病原体（病毒、胞内菌以及微生物成分等）等，这些激动剂可能通过一些信号，如离子通量（K+外排、Cl−外排、Na+内流和Ca2+动员等）、线粒体功能障碍、NLRP3刺激诱导的活性氧（ROS）和线粒体DNA（mtDNA）的释放、溶酶体破坏和反式高尔基体分解等途径激活NLRP3炎症小体[19]。

根据现有的人和小鼠研究进展，非经典激活则依赖人源caspase-4/-5或鼠源caspase-11激活。在小鼠细胞中，Toll样受体（TLR）和细胞因子受体的配体诱导转录因子NF-κB的激活和I型干扰素的产生，从而通过JAK/STAT通路或补体C3-C3aR轴上调caspase-11的表达，活化的caspase-11裂解GSDMD以驱动焦亡和NLRP3炎性依赖性caspase-1裂解。而caspase-4在人类细胞中高水平表达，因此不需要启动步骤。研究表明，革兰氏阴性菌释放的LPS可与小鼠caspase-11或人caspase-4/-5的CARD结构域结合，诱导caspase寡聚化和自体蛋白水解。此外，氧化磷脂1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（oxPAPC）已被证明直接与小鼠caspase-11和人caspase-4结合，并激活树突状细胞（DC）中的非经典NLRP3炎性小体[20]。

NLRP3炎症小体激活的替代途径中，单独的TLR配体可通过TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-caspase-8信号轴激活NLRP3炎症小体，这一途径在激活剂（如LPS）刺激后的人和猪单核细胞中的NLRP3炎性小体中得到了证实，但这种炎性小体缺乏经典和非经典NLRP3炎性小体激活的特征，包括ASC斑点形成、焦亡诱导或K+外排[21]。

图3. 经典、非经典和替代NLRP3炎性小体激活的机制[19]

3.NLRC4炎症小体

NLRC4炎症小体由NLRC4、ASC和pro-caspase-1组成。NLRC4又称IPAF，由3个结构域组成，N端为CARD效应结构域，负责下游信号转导；中段为NACHT结构域；C端为LRR，负责识别和结合PAMP等配体。

无活化信号时，NLRC4通过LRR结构域与NACHT结构域互作，抑制自身多聚体化而形成非活化状态，在NACHT结构域内由HD1、WHD、HD2形成一个特殊的ADP结合口袋，稳定NLRC4的非活性构象。当活化信号出现时，传感器蛋白凋亡抑制蛋白（NAIP）被激活，与NLRC4共组装形成NAIP-NLRC4炎性小体[22]。NAIP结合配体诱导NACHT结构域构象变化，HD1和HD2之间发生旋转，使LRR结构域构象变化，解除NACHT结构域的抑制，触发NLRC4寡聚化并暴露CARD效应结构域，最终导致NLRC4炎性小体被激活[23]。NLRC4可通过CARD-CARD相互作用直接募集和活化pro-caspase-1，激活的caspase-1触发GSDMD介导的细胞焦亡。一些研究表明，激活的NLRC4还可通过ASC促进这一过程，虽然ASC并非NLRC4炎性小体形成的严格要求，但ASC的缺失会降低caspase-1切割效率、减少IL-1β释放，这表明ASC增强了相关反应[24]。此外，NLRC4还可激活caspase-8，后者进一步激活caspase-3/-7以触发细胞凋亡。

小鼠基因组总共编码7种NAIP，而人类基因组仅编码1种NAIP（hNAIP）。小鼠mNAIP5、mNAIP6和人hNAIP可结合胞质溶胶中的细菌鞭毛蛋白，并与NLRC4相互作用，形成炎性小体。革兰氏阴性菌（如沙门氏菌、嗜肺军团菌和铜绿假单胞菌等）的鞭毛蛋白可通过Ⅲ、IV型分泌系统感染细胞，对NLRC4炎性小体的活化起重要作用。除鞭毛蛋白外，NAIP还识别细菌III型分泌系统（T3SS）的某些成分[25]。此外，hNAIP还可识别T3SS杆蛋白和针蛋白。同时，NLRC4炎性小体也能够被无鞭毛的细菌激活，如福式志贺菌，但具体机理尚不明确。

4.AIM2炎症小体

AIM2炎症小体由AIM2、ASC和pro-caspase-1组成，其核心AIM2是一种细胞质传感器，可识别外源或宿主来源的DNA分子，最早在人黑色素瘤细胞株中被发现，由于它在黑色素瘤细胞株中表达缺失且能逆转该肿瘤的表型而被命名为“黑色素瘤缺乏因子2”。AIM2包含两个典型结构域，一个为N端PYD结构域，其包含一个六螺旋束，与其他PYD结构域具有高亲和力；另一个为C端由一对串联的低聚糖/寡核苷酸折叠区组成的HIN结构域，可结合dsDNA或其他蛋白质，而一些ALR如IFI16在C末端含有两个HIN结构域[26]。

AIM2经细胞质内的细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体，或细胞质中异常存在的dsDNA激活后，适配器蛋白ASC募集procaspase-1，诱导炎症复合体的形成，从而激活caspase-1，并加工和释放GSDMD和促炎细胞因子IL-1β、IL-18等。AIM2通过PYD-PYD同型相互作用，再与ASC相互作用，导致螺旋丝状结构的组装，从而使AIM2炎症小体发生寡聚化，而HIN结构域以序列独立的方式与dsDNA结合。在缺乏配体的情况下，AIM2中PYD和HIN结构域之间的分子内相互作用使传感器保持为自抑制状态，抑制PYD介导的寡聚并抑制HIN-DNA结合；只有在dsDNA结合到HIN结构域，构象改变后才使得PYD结构域从HIN结构域上解离，使下游信号传递到适配器ASC[27]。

研究表明，弗朗西斯菌、牛痘病毒和小鼠巨细胞病毒、烟曲霉都是AIM2炎性小体的配体，李斯特氏菌也能使之部分激活；当某些物质（如胆固醇的过度积累）导致细胞核膜或线粒体膜完整性受损，DNA泄露至胞质也可引起AIM2炎性小体激活[28]。dsDNA有效激活AIM2炎性小体的能力取决于其长度，有研究表明70bp的dsDNA是最小激活长度，200 bp的dsDNA可实现最佳的AIM2激活，300 bp的dsDNA诱导AIM2聚合速度显著快于72 bp[29]。

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