siRNA 和shRNA的区别

在1998年Andrew Fire 和Craig Mello发现了一种双链RNA，这种RNA能抑制秀丽隐杆线虫基因的表达，他们将这种现象命名为RNA干扰（RNA interference，RNAi）¹。从发现至今，RNAi 是科研中最常见的基因缺失策略，具有高度的特异性，可用于调控基因和蛋白质的表达，这是传统的药理学方法难以企及的²。

RNAi 可以通过两种分子来实现：一种是通过化学合成的双链小干扰 RNAinterfering RNA ，siRNA);另一种是构建到载体上的短发夹RNA（short hairpin RNA ，shRNA）。siRNA 是最早应用在RNAi上的，随后人们发现通过将siRNA添加到一个短发夹结构上并构建到质粒上，能被细胞的RNA聚合酶III识别并启始转录^1,3,4。虽然siRNA和shRNA有相同的功能，但是分子作用机制、干扰途径、脱靶效率和应用范围是有所不同的，本质上是两种不同的分子⁵。

siRNA

siRNA 是人工直接合成的，一般是21-25nt的带有两个游离双链RNA，通过转染试剂（如RNAFit）将 siRNA 转入到细胞的细胞质中，与细胞质中的一些蛋白相互作用，其中的一条链与一些蛋白形成转录沉默复合物⁵。

siRNA 适用条件

siRNA 是人工合成的，相对价格较为便宜，虽然对 siRNA 的效果的预测方法已经日趋成熟，但是siRNA效果仍需要试验去验证，所以在经济条件允许的情况下建议多定制几条siRNA去筛选出一条干扰效果最好 siRNA 也不失为一种节省时间的好方法。此外值得注意的是siRNA 的转染是需要转染试剂的，如果要研究的细胞对转染试剂敏感，容易死亡，需要更换其他的转染试剂或者改用病毒携带shRNA。

此外，siRNA可以通过化学修饰添加不同的功能，比如汉恒的siRNA产品中会带有荧光标记的阴性对照（如Cy3），转染后3h左右，能在荧光显微镜下看到荧光⁶，通过这个方法可以判断siRNA是否能进入到细胞内，以此排除转染过程中是否存在问题。此外，已有大量的研究通过化学修饰，来增加siRNA的稳定性和细胞的亲和力，同时也要兼顾对干扰功能的影响⁷，比如在动物实验中常用到的甲氧基和胆固醇双修饰。

shRNA

shRNA包含一个正义序列和一个反义序列，并由环结构分隔。与siRNA不同的是，shRNA需要在细胞内转录生成的，在细胞核和细胞质中加工后才形成具有沉默作用的 RISC，为了提高shRNA的加工效率，这一个过程被设计的有点类似miRNA的成熟过程⁵，此外使用非U6 启动子时，要把shRNA上添加miR-30结构⁸。

因为shRNA是通过载体（质粒或病毒）转录而来，这样shRNA就具备siRNA不能具有的优势：

1. 表达维持时间长，siRNA一般能维持3-5天的效果，而 shRNA可以使用不同的载体进行过表达，比如使用腺病毒作为在体，在细胞实验中有较高的感染效率，而且shRNA 的表达能维持1-2周左右。此外，利用慢病毒能将基因整合到宿主基因组的能力，理论上能让shRNA在细胞系中稳定表达，也就是获得稳转细胞株。
2. 能设计成为诱导性，shRNA可以设计到tet-on/off系统或cre/loxp 系统中⁹，可以诱导干扰序列的表达或者抑制。
3. 能设计组织器官表达特异性，在动物实验中，shRNA能构建到腺相关病毒上，腺相关病毒具有维持表达时间长，病毒免疫原性低的特点，这是siRNA 不具备的优势，此外，根据试验的需求，可以将shRNA前添加组织特异的启动子，这样shRNA只能在某一特定的器官中表达，减少对实验的干扰。

综上，选择siRNA还是shRNA要根据自己的实际需求而定的，两种都是可行的方法。

1. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998;391(6669):806-811.

2. Liu S. RNA Interference Ex Vivo. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2018;1868:129-135.

3. Yu JY, DeRuiter SL, Turner DL. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2002;99(9):6047-6052.

4.Miyagishi M, Taira K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature biotechnology. 2002;20(5):497-500.

5. Rao DD, Vorhies JS, Senzer N, Nemunaitis J. siRNA vs. shRNA: similarities and differences. Advanced drug delivery reviews. 2009;61(9):746-759.

6. Järve A, Müller J, Kim IH, et al. Surveillance of siRNA integrity by FRET imaging. Nucleic acids research. 2007;35(18):e124.

7. Takabatake Y, Isaka Y, Mizui M, Kawachi H, Takahara S, Imai E. Chemically modified siRNA prolonged RNA interference in renal disease. Biochemical and biophysical research communications.2007;363(2):432-437.

8. Silva JM, Li MZ, Chang K, et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature genetics. 2005;37(11):1281-1288.

9. Kühn R, Streif S, Wurst W. RNA interference in mice. Handbook of experimental pharmacology. 2007(178):149-176.