一文掌握内皮细胞基因调控策略

在内皮细胞靶向的早期研究中，体外实验发现，AAV1 和 AAV5 血清型相对于 AAV2 具有更高的内皮细胞转导效率。AAV1在转导后7天表现出最高的转导效率，AAV5 载体在第14天和第21天表现出更强且更稳定的表达水平，甚至超过了AAV1。因此，AAV5血清型被认为是对血管内皮细胞具有较好的嗜性[12]。

图4. AAV1，AAV5血清型体外感染内皮细胞效率比较

图5是客户使用汉恒生物提供的跨血脑屏障血清型AAV-BR1血清型过表达TIMP1或者AlaTIMP1基因。尾静脉注射小鼠AAV-BR1-TIMP1-Flag或AAV-BR1-AlaTIMP1-Flag两周后，通过Flag（绿色）和内皮细胞标记物CD31（红色）的免疫荧光染色分析目的基因在脊髓皮层中的表达情况[13]。

图5. BR1血清型感染脊髓内皮细胞

AAV-BR1更倾向于感染脑微血管内皮细胞，即毛细血管内皮细胞，对于动脉和静脉内皮的感染效率相对不足。为了解决这一问题，科研人员在AAV9血清型的基础上进行改造，并命名为AAV-BI30血清型。经实验验证，AAV-BI30能够有效感染脑部动脉、静脉和毛细血管的内皮，而AAV-BR1主要局限于毛细血管内皮，如图6所示。因此，相比于AAV-BR1血清型，AAV-BI30感染脑血管内皮细胞的效率更高、用途更广。除大脑外，对整个中枢神经系统和视网膜血管的内皮细胞也有很好的嗜性[14]。

图6. AAV-BI30高效转导大脑动、静脉内皮细胞

图7展示的结果是研究人员开发的AAV-GEC血清型在静脉注射小鼠后，可以特异且高效地靶向肾小球内皮细胞，这为肾小球炎症的肾病治疗提供了可能[15]。

图7. AAV2-GEC特异性转导肾小球内皮细胞

为了高效特异性靶向血管内皮细胞，研究人员构建了带内皮靶向肽VSSSTPR（“Vec”）突变型衣壳，以及之前报道的内皮靶向肽NNPLPQR（“Nec”）突变型衣壳以及野生型AAV2衣壳的腺相关病毒，分别体外感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC），观察其对HUVEC细胞的感染效率。结果在不同梯度的GOL（genome-per-cell ratio）条件下，AAV-Vec感染HUVEC细胞的效率均明显高于AAV-Nec以及AAV2，显示了AAV-Vec具有良好的血管内皮细胞的特异性[16]。

图8. AAV-Vec高效感染血管内皮细胞

二、组织特异性启动子

特异性血清型AAV可以实现组织或细胞特异性感染，然而利用特异性血清型所靶向的范围仍然较宽，如果要在某种特定内皮细胞上实现基因表达调控，仅使用不同的特异性血清型是难以实现的，而特异性启动子就可以提供更多选择（如表2所示）。因此，除了使用特异性血清型外，还可以利用特异性启动子来实现目的基因特异性表达的目的。

表2. 内皮细胞特异性启动子

图9是作者使用汉恒生物公司构建的AAV-Tie2-circGNAQ病毒载体，通过尾静脉注射小鼠（(1.6 X 10^11 vector genomes [vg]/mice），载体携带Tie2启动子，使得circGNAQ的表达仅限于内皮细胞。最终在小鼠主动脉内膜中检测到circGNAQ的表达量显著高于对照组[17]。

图9. 主动脉内皮细胞特异性过表达circGNAQ

图10作者使用汉恒生物公司构建的腺相关病毒AAV-Vec-Tie1-Pfkfb3和AAV-Vec-Tie1-mir30-Pfkfb3，通过尾静脉注射小鼠（100ul/每只小鼠），特异性地在小鼠心脏内皮细胞中实现Pfkfb3的过表达和敲低，并证明了心脏内皮细胞中Pfkfb3的异常表达参与了内皮细胞向肌细胞转化相关的心脏纤维化[18]。

图10. 心脏内皮细胞特异性过表达或敲低Pfkfb3

图11是汉恒生物构建的NHLRC2过表达和干扰腺相关病毒，通过淋巴血管内皮细胞特异性启动子LYVE-1启动子调控NHLRC2的表达。通过侧脑室注射aav病毒（5μL/每只小鼠，注射速度0.2μL/min，病毒滴度1x10^12 vg/ml），实现了在小鼠软脑膜淋巴血管内皮细胞（leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells, LLECs)特异性操控基因表达的目的[19]。

图11. 携带LYVE-1启动子的AAV病毒注射侧脑室注射小鼠

肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）是位于肝窦内的高分化内皮细胞，占肝脏细胞20%左右，在调控肝再生、纤维化、脂肪变性等肝脏内各种病理生理过程中起着关键作用。人们已经意识到LSECs的重要作用，但特异性标识LSECs的Marker基因的缺乏，限制了对其分子特性和功能特征的研究。2023年，空军军医大学研究团队通过多种单细胞RNA测序分析发现Oit3是LSECs最特异的Marker，并且构建了Oit3驱动的CreERT2转基因小鼠，并与Rosa26-tdTomato报告小鼠杂交，获得了Oit3-CreERT2-tdTomato小鼠，当Cre酶被激活表达后，Oit3驱动的细胞就会标记为tdTomato，这为探索LSECs在生理和病理状态下的复杂功能和机制提供了可靠的方法[20]。

图12. Oit3是肝窦内皮细胞特异性Marker

三、AAV注射方式

在靶向血管内皮细胞过程中，常常可以采用系统性注射（尾静脉注射）、原位注射、脑立体定位注射（针对脑血管内皮细胞）等不同的注射方法。尾静脉注射感染范围较广，操作简单，搭配内皮细胞特异性血清型和特异性启动子，是实验中使用比较多的一种注射方法。

图13是来自于汉恒生物的客户发表的一篇文章，作者是想靶向肺内皮细胞，用到了AAV-Vec血清型病毒，同时载体携带Tie启动子，通过气道递送AAV至靶细胞（50μL/每只小鼠，1*10^12 VG/ml）。注射AAV病毒4周后，在靶细胞中检测到基因的表达。

图13中，者利用气道给药方式将汉恒生物提供的腺相关病毒AAV-Vec-Tie，递送至肺内皮细胞（50μL/每只小鼠，1*10^12 VG/ml）。并在AAV病毒给药4周后，在靶细胞中检测到目的基因的表达[21]。

图13. AAV经气道注射至肺脏内皮细胞

此外，还可采用Cre依赖性基因开关（Cre-loxp系统）实现内皮细胞特异性基因表达调控，如用特异性启动子启动cre酶的AAV病毒载体注射至Loxp小鼠、向特异性启动子启动cre酶的小鼠注射Loxp控制靶序列的AAV来实现特异性基因表达调控的目的。

本期内容到这里就结束了，下期我们将会分享自噬相关基因的干货文章，敬请关注。

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