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上期为大家介绍了甲亢以及甲亢的造模方法，本期我们将系统介绍T细胞的特异性基因调控策略，主要从T细胞的简介、T细胞的分类、体外T细胞的感染、体内特异性靶向T细胞感染的载体、体内特异性靶向T细胞感染的注射方式和剂量等五个方面展开分享。
一、T细胞的简介
T细胞，全称T淋巴细胞，是一种特殊类型的白细胞，在外周血中约占淋巴细胞总数的65% ~ 75%，由来源于骨髓的造血干细胞在胸腺中分化并发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的器官和组织中发挥免疫功能，T细胞是适应性免疫系统中的关键组成部分。T细胞具有独特的表面受体，被称为T细胞受体（T cell receptor，TCR），常以异二聚体的形式存在（90%以上的TCR由α链和β链组成，约5%的TCR由γ链和δ链组成），它能够特异性识别抗原并介导免疫反应，在调节 T 细胞迁移、分化和成熟方面起着决定性作用，由于 TCR 的胞外段非常短，无法自行完成信号传导，因此 TCR 需要一个辅助分子，而 CD3（Cluster of Differentiation 3）即承担了这一角色，CD3是T细胞膜上重要的生物标志物，由四个蛋白链亚基（CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3δ）组成，CD3通过非共价键与 TCR 结合形成 TCR-CD3 复合物，TCR-CD3 复合物是 T 细胞特异性识别抗原并传导信号的分子基础[1]。
图1. T细胞的表面的TCR-CD3复合物[1]
二、T细胞的分类
① 根据表面CD分子的不同，T细胞可以分为：
CD4+ T细胞：细胞表面标志性分子为CD4，占总T细胞的60% ~ 70%，识别MHC II类分子呈递的抗原，这些细胞活化后通过分泌细胞因子，调动其他免疫细胞，如B细胞、巨噬细胞和树突状细胞，帮助协调和放大免疫反应。
CD8+ T细胞：细胞表面标志性分子为CD8，占总T细胞的30%~40%，识别MHC I类分子呈递的抗原，激活后变身为细胞毒性T细胞，释放穿孔素、颗粒酶等直接杀死被病毒或细菌感染的细胞、肿瘤细胞。
② 根据表达的TCR类型不同，T细胞可分为：
αβ T细胞：占总T细胞的95%-99%，表面表达的TCR由α链和β链组成，能特异性识别由MHC分子（通常为MHC I或II类分子）呈递的肽抗原，因此核心作用是介导抗原特异性免疫应答。广泛分布于血液、淋巴结、脾脏及其他淋巴组织，在抗感染、抗肿瘤及免疫调节等过程中发挥中枢作用。
γδ T 细胞：仅占T细胞总数的1%-5%，表面表达的TCR由γ链和δ链组成。γδ T细胞对抗原的识别方式多样，不依赖MHC分子，能对多种应激刺激产生快速反应，在感染防御、组织修复和炎症反应中具有重要作用。其优势在于非特异性、早期应答，γδ T细胞弥补了αβ T细胞激活前的防御空白。它们主要分布在皮肤、肠道、呼吸道等上皮及黏膜组织，是机体固有免疫系统的重要组成部分。
③ 按激活状态分类，T细胞可分为：
辅助性T细胞（Helper T cell，Th）：属于CD4+ T细胞亚群，是调节免疫应答的关键细胞。根据所分泌细胞因子的不同，主要分为Th1、Th2、Th17、Tfh等。Th1主导细胞免疫，促进巨噬细胞活化；Th2 促进B细胞产生抗体，主导体液免疫；Th17参与黏膜防御和炎症调节；Tfh帮助B细胞在淋巴器官形成生发中心。辅助性T细胞的平衡失调常与过敏和自身免疫疾病等相关。
细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cell，CTL）：大多属于CD8+ T细胞，激活后通过分泌穿孔素、颗粒酶等方式直接杀伤受感染细胞或肿瘤细胞。其激活需要抗原递呈细胞（APC）和多种细胞因子的协助。CTL同时具有记忆功能，为宿主再次遭遇同一病原体时提供快速应答。
调节性 T 细胞（Regulatory T cell，Treg）：调节性T细胞一般为 CD4+ CD25+ Foxp3+表型，主要分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，抑制过度免疫反应，维护免疫耐受、减少自身免疫病发生。Treg细胞也参与器官移植的免疫耐受和肿瘤微环境的免疫抑制，是当前免疫治疗的重点研究对象之一。
④ 按免疫功能分类，T细胞可分为：
初始 T 细胞（Naive T cell）：在胸腺内完成分化、离开胸腺进入外周免疫器官、尚未遇到抗原刺激的成熟 T 细胞。初始 T 细胞处于细胞周期G0期、代谢低，易于在血液与淋巴系统中循环。当机体首次遭遇特定抗原时，这些细胞能迅速激活和增殖，并根据外部刺激分化为效应 T 细胞或记忆 T 细胞。
效应 T 细胞（Effector T cell）：来自初始 T 细胞，经抗原激活和分化。活化后脱离淋巴器官、迁移到炎症或感染部位，这类细胞能在短时间内大量产生免疫因子、执行免疫防御，免疫反应后大多数效应 T 细胞凋亡，仅有极少数转化为记忆 T 细胞。
记忆 T 细胞（Memory T cell）：在免疫反应后期由存活下来的效应 T 细胞分化形成，具有长期存活、自我复制和快速应答二次抗原刺激的能力。根据表面分子CCR7的不同，分为中央记忆 T 细胞（Tcm，CCR7+，主要分布在二级淋巴器官，对抗原二次识别时能迅速扩增）和效应型记忆 T 细胞（Tem，CCR7-，多见于外周组织，可迅速产生效应分子）。记忆 T 细胞能维持数年甚至更久，对二次感染提供快速、增强的免疫保护。
由于T细胞疗法技术的日渐成熟，针对T细胞体内外感染的研究文献逐年增多。体外T细胞的感染主要是针对上述CD4+T细胞和CD8+T细胞仅进行体外相关实验的研究，而体内T细胞的研究主要是通过靶向AAV载体对T细胞进行特异性感染的方式，但也允许体内提取的T细胞在体外通过基因编辑等技术进行治疗，随后回输至动物体内实现精准的靶向疗法等操作。那么我们就一起来了解下T细胞体内外感染的操作方法及使用案例。
三、体外T细胞的感染
汉恒生物适用于原代 T 细胞感染的病毒产品包括T 细胞专用慢病毒、逆转录病毒和悬浮细胞专用腺病毒。其中慢病毒和逆转录病毒可以用来构建稳转细胞系，悬浮细胞专用腺病毒适用于瞬转实验。那我们就来了解下体外T细胞的感染步骤以及汉恒客户的T细胞感染使用案例：
（1）体外T细胞的感染步骤
① T细胞激活培养48 h后，离心换新鲜T细胞完全培养基，若考虑长期表达目的基因，可按MOI=50-100摸索最适值并加入慢病毒或逆转录病毒，加入病毒后轻轻吹打混匀；若考虑瞬时（一周以内）表达目的基因，可按 MOI=500-1500摸索最适值并加入汉恒悬浮细胞专用腺病毒。进行病毒感染操作时，可选择同时加入适宜浓度的polybrene（polybrene常规使用浓度为1-10 μg/mL）。
注：具体 MOI 选择可在 96 孔板中预实验进行梯度摸索，对于慢病毒建议使用 10，30，50，100的梯度进行，对于腺病毒建议使用500，1000，1500的梯度进行摸索。
② 置于平板离心机离心60 ~ 90 min，转速1000 g左右（如细胞敏感可以降低转速至200 ~ 300 g，如细胞不敏感最高可升至1200 g）。离心结束后将平板放入37 ℃培养箱感染 4 ~ 24 h（敏感细胞可尽早换液）。注：离心结束观察细胞分散状态，除非细胞全聚集在一处，否则不建议吹散细胞。
③ 感染结束后取出培养板，吸弃含病毒液的培养基，加入T细胞完全培养基。
④ 将细胞放入培养箱中继续培养，如病毒带荧光基因，可在病毒感染48 h后观察荧光，观察病毒感染效率。
案例1. 慢病毒感染小鼠CD8+ T细胞
文献标题：CDK4/6 Inhibitor Priming Enhances PD-1 Blockade via Sellhi Neutrophil-Induced Stat5a+ Progenitor Exhausted CD8+ T Cell
发表杂志：《Advanced Science》（IF=14.1）
病毒种类：HBLV-CMV-mStat5a-3flag-EF1-T2A-Puro
使用方法：将慢病毒采用离心感染法（900 g，25 ℃，3 h）转导CD8+ T细胞，polybrene的使用浓度为10 μg/mL。
图2. 慢病毒感染CD8+ T细胞[2]
案例2. 悬浮细胞专用腺病毒感染小鼠 T 细胞
文献标题：Engineered peripheral CD4 T cells delivery across the BBB promote intracerebral Treg conversion unleashes microglial phagocytotic activity for Alzheimer's disease treatment.
发表杂志：《Biomaterials》（IF=12.9）
病毒种类：悬浮细胞专用腺病毒
使用方法：将CD4+T细胞与5 μg/mL polybrene在24孔板中共培养30 min，然后加入腺病毒（MOI= 500），培养6 h。随后，对T细胞进行洗涤，并继续用腺病毒感染24 h，最后收集细胞用于后续检测。
图3. 悬浮细胞专用腺病毒感染小鼠T细胞[3]
四、体内特异性靶向T细胞感染的载体
T细胞在免疫治疗以及药物靶向递送方面的潜力巨大，已逐渐成为研发的热点，而腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）因为安全性高、宿主范围广、靶向性强作为基因递送的工具被广泛使用，但早期AAV血清型对T细胞的特异性转导效率较低，限制了应用。2023年，Nyberg等人通过结构引导进化的方法，针对AAV6进行突变筛选，最终获得了Ark313这一新型AAV血清型[4]，研究发现Ark313能够有效靶向循环T细胞、脾脏T细胞和组织驻留T细胞[5]，在脾脏T细胞中可以实现高达10.2%的转导效率，并且对比了AAV5、AAV6与Ark313的转导效率，结果显示，仅Ark313在脾脏CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中实现了大于10%的转导效率[5]。
图4. Ark313血清型在体内可以有效转导T细胞[5]
2024年，南京医科大学周文斌、王水等人使用AAV-Ark313血清型并结合DIO系统成功敲低了CD8a-Cre小鼠的CD8+T细胞中的STAT1基因的表达，证实了STAT1在联合疗法中调控T细胞记忆分化的关键作用[6]，该研究团队使用的AAV-Ark313由汉恒生物提供。
图5. CD8a-cre小鼠注射AAV-Ark313感染CD8+T细胞[6]
五、体内特异性靶向T细胞感染的注射方式和剂量
由于T细胞分布范围广，更适合用系统性注射的方式感染体内T细胞，上文提到的Nyberg等人就是用静脉注射的方式感染小鼠体内T细胞，以及南京医科大学周文斌、王水等人也是用静脉注射（用量：200μl）的方式感染小鼠体内的CD8+ T细胞。也可采取体外分离感染T细胞后再回输体内的方式进行靶向治疗，Sidi Chen等人从Cas9转基因小鼠的脾脏和淋巴结肿瘤中分离了原代CD8+ T细胞，并使用AAV6介导的sgRNA病毒库感染激活的CD8+ T细胞，之后通过尾静脉注射将这些CD8+ T细胞回输到小鼠体内再进行后续研究[7]。
图6. CD8+ T的体外分离感染并回输[7]
综上所述，相信大家对T细胞的基因调控方式有了一个初步了解，除本文介绍的慢病毒、悬浮细胞专用腺病毒和AAV-Ark313外，汉恒生物还研发了靶向神经、肌肉、肾脏、肝脏、视网膜、胰腺等组织器官的AAV特异性启动子和特异性血清型，使用合适的血清型和特异性启动子，可对不同组织、器官进行高效靶向感染，欢迎各位老师咨询，下期我们将介绍对内皮细胞的特异性基因调控策略，请小伙伴们继续关注哦！
参考文献：
[1] Liu DY,Hu XX,Chen ZY,Wei W,Wu YJ. Key links in the physiological regulation of the immune system and disease induction:T cell receptor-CD3 complex. Biochem Pharmacol.2024 Sep:227:116441.doi: 10.1016/j.bcp.2024.116441.
[2] Zhang Y,Sun B,Zhou R.et al.CDK4/6 Inhibitor Priming Enhances PD-1 Blockade via Sellhi Neutrophil-Induced Stat5a+ Progenitor Exhausted CD8+ T Cell.Adv Sci.2025 Sep 11:e10501.doi: 10.1002/advs.202510501.
[3] Zuo ZJ,Xiao ZC,Zhang LY.et al.Engineered peripheral CD4 T cells delivery across the BBB promote intracerebral Treg conversion unleashes microglial phagocytotic activity for Alzheimer's disease treatment.Biomaterials.2026 Feb:325:123574.doi: 10.1016/j.biomaterials.2025.123574.
[4] William A Nyberg, Jonathan Ark, Angela To.et al. An evolved AAV variant enables efficient genetic engineering of murine T cells. Cell. 2023 Jan 12; 186(2): 446–460.e19. doi: 10.1016/j.cell. 2022.12.022.
[5] William A Nyberg, Charlotte H Wang, Jonathan Ark.et al. In vivo engineering of murine T cells using the evolved adeno-associated virus variant Ark313. Immunity.2025 Feb 11;58(2):499-512.e7.doi: 10.1016/j.immuni.2025.01.009.
[6] Tang XY,Mao XR,Ling PW.et al. Glycolysis inhibition induces anti-tumor central memory CD8+T cell differentiation upon combination with microwave ablation therapy. Nat Commun.2024 May 31;15(1):4665.doi: 10.1038/s41467-024-49059-6.
[7] Lupeng Ye,Jonathan J Park, Matthew B Dong.et al.In vivo CRISPR screening in CD8 T cells with AAV-Sleeping Beauty hybrid vectors identifies membrane targets for improving immunotherapy for glioblastoma. Nat Biotechnol.2019 Nov;37(11):1302-1313.doi: 10.1038/s41587-019-0246-4.
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