Cell|当代谢废料成为“致命武器”：揭秘调节性T细胞如何利用氨代谢破坏免疫战局

2025年12月，徐州医科大学吕凌团队联合南京医科大学第一附属医院古鉴团队在《Cell》期刊上发表了题为“Tumor-produced ammonia is metabolized by regulatory T cells to further impede anti-tumor immunity”的研究论文。该研究深入揭示了肿瘤微环境中调节性T细胞（Treg）通过代谢氨增强其免疫抑制功能的分子机制，为理解肿瘤免疫逃逸及免疫治疗耐药提供了新视角。值得注意的是，文章中使用了汉恒生物提供的pGL3-SMS-promoter和pcDNA3.1-FOXP3质粒来研究FOXP3和SMS基因之间的调控关系，为结论提供了关键实验支持。

在肿瘤进展过程中，Tregs会在肿瘤微环境（TME）中逐渐积累并抑制抗肿瘤免疫反应，而效应T细胞的数量则相应减少。Tregs通过何种机制来适应不断恶化的TME，一直是肿瘤免疫治疗领域的未解之谜。肝细胞癌（HCC）是一种高度恶性的肿瘤，其对抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/抗程序性死亡配体1（PD-L1）治疗的应答率低于20%。肝脏是氨代谢的主要场所，因而作者推测Tregs可能通过适应重塑的氨环境来抑制肿瘤免疫反应。

本研究通过空间代谢组学与转录组学分析发现，人类HCC中存在代谢异质性亚区，这些区域谷氨酰胺分解代谢活跃，氨水平升高，且Tregs富集，而效应T细胞（CD8⁺T和CD4⁺T）则出现死亡。机制上，一方面Tregs通过上调精氨基琥珀酸裂解酶（ASL），启动尿素循环来消除氨的毒性；另一方面，氨还能在FOXP3转录因子调控的精胺合成酶（SMS）作用下转化为精胺。X射线晶体学证实，精胺与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）直接结合，进而全面调控多种线粒体复合体蛋白的转录，以增强Tregs的氧化磷酸化（OXPHOS）和免疫抑制功能。临床层面，经抗PD-1治疗后死亡的肿瘤细胞通过转氨脱氨作用释放氨，进而增强Treg功能，最终导致免疫治疗耐药。因此，靶向氨生成以抑制Tregs，有望成为抗肿瘤免疫治疗的潜在策略。

图1.Treg适应肿瘤氨代谢的分子机制

下面，我们一起来了解具体的研究内容：

1. 高谷氨酰胺代谢-低尿素循环的肿瘤亚区富集Treg

为了阐明肿瘤区域代谢特征与免疫细胞分布之间的关系，作者首先对6例肝癌患者的组织样本进行了空间转录组和空间代谢组分析（图2A），发现Treg主要分布在肿瘤组织，其他免疫细胞则主要集中在癌旁组织（图2B-C）。通过分析不同免疫细胞浸润区域（尤其是Treg区域）的能量代谢特征，并结合KEGG分析结果，作者发现不同T细胞亚型的分布区域具有独特的代谢特征，肿瘤中Treg富集区域表现出一种独特的代谢特征：高度活跃的谷氨酰胺分解和显著降低的尿素循环活性（图2D-H）。在小鼠肝癌模型中，这一空间相关性和代谢特征得到了进一步验证：随着肿瘤进展，谷氨酰胺分解活性升高，瘤内氨浓度增加，Treg丰度同步增加。

图2. 谷氨酰胺分解代谢活跃和尿素循环活性降低是肿瘤中Treg富集区域的关键代谢特征

谷氨酰胺分解的主要副产物是氨，而尿素循环是清除氨的主要途径，二者共同造就了一个高氨的环境。作者猜测，局部氨积累可能是驱动Treg富集的关键因素，并利用体内外实验进行验证，发现在尿素循环活性相对较高的肿瘤样本中，氨水平较低，Treg富集也较弱（图3J）。体内实验也显示，肿瘤内注射氨会促进肿瘤生长并提高Treg富集（图3K-L）。

图3. 氨促进肿瘤生长并提高Treg富集

2. Treg而非CD8+T或CD4+T细胞可抵抗氨诱导的细胞凋亡

那为何氨会选择性地“偏爱”Treg呢？作者将从健康外周血单个核细胞（PBMCs）中分离出的Treg、CD8+T和CD4+T细胞置于不同的NH4Cl浓度环境中进行实验，发现与肿瘤内浓度相当的氨（5mM）几乎不影响Treg的增殖，却显著抑制了CD8+T和CD4+T细胞的增殖，高浓度的氨（10mM和20mM）会抑制所有细胞增殖，对CD8+T和CD4+T细胞影响更明显（图4A）。流式细胞术和蛋白印迹结果显示低氨（5mM）环境下，CD8+T和CD4+T细胞会发生细胞凋亡，而Treg则表现出抵抗凋亡的能力（图4B-C）。此外，低浓度氨处理后的Treg，其关键转录因子FOXP3和肿瘤免疫抑制性分子PD-1、CTLA-4的表达上调，免疫抑制功能增强（图4D-E）。动物实验结果与细胞实验一致，高氨饮食的小鼠脾脏和外周血中的Treg丰度增加，CD8+T和CD4+T细胞丰度降低，注射鸟氨酸（可减少氨的积累）则能够逆转这些效应（图4F-J）。以上数据表明Treg在氨胁迫下具有明显的生存和功能优势，而效应T细胞则高度敏感。

图4. Treg能够抵抗氨诱导的细胞凋亡

3. 氨通过上调ASL的表达激活Treg中的尿素循环

基于以上实验结果，作者提出假设：Treg在氨代谢方面比其他T细胞亚群表现得更为出色。为验证这一假设，作者从HCC样本中分离出Treg、CD8+T细胞和CD4+T细胞检测。发现相比CD8+T和CD4+T细胞，Treg中的氨水平较低，且存在大量的尿素循环中间产物（图5A-B）。利用15N标记的氨进行示踪实验，发现Tregs中尿素循环中间产物的同位素掺入量更高（图5C-D）。这些结果表明在富氨环境中，Treg具有较强的尿素循环活性。

氨是如何驱动Treg的尿素循环的呢？带着这个疑问，作者分析了HCC的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，发现肿瘤浸润的Treg会特异性地高表达尿素循环中的一个关键酶——ASL（图5E）。使用5mM的NH4Cl处理Treg，结果显示ASL的mRNA和蛋白水平均上调，与scRNA-seq结果一致，说明氨通过上调ASL来诱导Treg中尿素循环的激活。ASL敲低后，Treg中氨含量升高，增殖能力和抗凋亡能力减弱，尿素循环能力受损（图5I-N）。这揭示了Treg感知和适应氨压力的第一道防线：ASL介导的尿素循环激活。

图5. 氨通过上调ASL的表达激活Treg中的尿素循环

4. 氨通过SRC3介导的STAT3激活作用，增强Treg中的ASL转录过程

接着，作者进一步探究ASL的上游通路，通过分析氨处理Treg的RNA测序（RNA-seq）数据，发现信号转导及激活转录因子3（STAT3）可激活ASL表达，药物抑制或者敲低STAT3均会抑制氨对ASL的上调作用（图6N-P）。转录因子与启动子的双荧光素酶报告基因实验验证STAT3作为转录因子与可结合在ASL的启动子区域来激活其转录，结合位点为ASL启动子上游263-271bp（图6S-U）。通过免疫沉淀实验，发现类固醇受体共激活因子3（SRC3）是氨诱导的STAT3共激活因子中的重要成员（图6V）。单细胞分析显示，SRC3的表达与肿瘤内Treg中的抗原呈递淋巴小结（ASL）呈特异性且正相关（图6W至S3Y）。氨诱导能够增强Treg中STAT3-SRC3复合物形成，激活ASL转录，降低细胞凋亡，敲低SRC3后上述效应会受到抑制，过表达野生型SRC3后可恢复这些效应（图6AB至S3AE）。

综上，氨促进了SRC3与STAT3的相互作用，从而驱动ASL的转录过程，这一机制解释了Treg在TME中感知和适应氨压力的独特能力。

图6. 氨通过上调ASL表达激活Treg的尿素循环

5. 氨通过由FOXP3调控的SMS表达，促进Treg中的OXPHOS

氨含量丰富的肿瘤微环境中，Treg的OXPHOS通路显著富集，线粒体功能检测也证实，氨处理提升了Treg的耗氧率（OCR）、ATP产量和线粒体膜电位，而CD8+T和CD4+T细胞则没有这种变化（图7A-F）。氨能够诱导Treg中FOXP3上调，增强Treg中肿瘤免疫抑制分子的表达，然而这些效应均会被OXPHOS抑制剂消除，说明OXPHOS的增强对于维持FOXP3表达和Treg的肿瘤免疫抑制功能至关重要。

利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）技术，作者发现HCC和Treg中与氨代谢相关的SMS基因上调，与肿瘤来源Treg中精胺水平升高现象一致（图7G-I）。敲低Treg中的SMS后，会抑制OCR的增强、破坏线粒体的完整性，并抑制精胺的产生（图7J-K），另外，敲低SMA还会导致OXPHOS减弱，线粒体基因表达下调，免疫抑制功能受损（图7L-N）。根据JASPAR和PROMO数据库预测结果，FOXP3是SMS的潜在调节因子，利用转录因子与启动子的双荧光素酶报告基因实验，作者确认FOXP3是SMS的转录激活因子，染色质免疫共沉淀（ChIP）-qPCR和电泳迁移率变动分析（EMSA）的结果与双荧光素酶报告基因实验结果一致（图S4O-V）。这些结果确立了FOXP3作为驱动SMS表达的转录激活因子，增强了氨诱导的Treg的OXPHOS水平。

图7. 氨通过FOXP3-SMS轴促进Treg的OXPHOS

6. 精胺通过PPARγ促进Treg的OXPHOS并增强其免疫抑制能力

SMS能促使精胺降解转化为精氨酰胺，作者在SMS敲低的Treg中补充精胺，发现当精胺转化为精氨酰胺后，显著增强了Treg的OXPHOS水平（图8A-C）。过表达精胺/精胺N(1)-乙酰转移酶SAT1（精胺降解的限速酶）后，精胺、精氨酰胺、OXPHOS水平均下降（图8D-F）。表明精氨酰胺是驱动氨诱导条件下Treg发生OXPHOS的关键代谢物。

精氨酰胺如何增强OXPHOS？为阐明这一机制，作者开发了精胺衍生物探针SPM-DA，通过蛋白质组学技术，结合液相色谱-质谱分析、反向靶标筛选和基于RNA-seq的转录因子预测，作者锁定了一个关键靶点：过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）（图8G-N）。NH4Cl处理Treg后PPARγ的表达未出现明显变化。然而，在Treg中敲低PPARγ会抑制NH4Cl诱导的高OCR（图8O-P）。Treg特异性PPAR-γ敲除（Pparγfl/flFoxp3YFP-Cre）小鼠的氨诱导实验和皮下成瘤实验进一步验证，NH4Cl或内源性精胺通过靶向PPARγ来增强Treg的功能。

图8. 精胺通过PPARγ增强Treg的OXPHOS和免疫抑制能力

作者利用微尺度热泳分析（MST）、等温滴定热分析（ITC）、细胞热位移测定法（CETSA）和药物亲和响应靶稳定性（DARTS）验证了精胺与 PPARγ之间存在直接相互作用（图9A-D）。通过X射线晶体学、分子对接和突变分析，作者精确定位了精胺与PPARγ结合的关键氨基酸位点Glu319, Ser370, Glu371（图9E-H），将这些位点突变为Ala，生成PPARγ-MUT蛋白，有效地消除了与精胺的结合（图9I-6L）。PparγMutFoxp3YFP-Cre小鼠的CETSA和DARTS实验结果显示Treg中PPARγ与精胺的结合稳定性显著降低（图9M-N）。此外，精胺-PPARγ复合物通过上调多个线粒体呼吸链复合物的基因表达，增强了Treg的OXPHOS。

图9. 精胺与Treg中的PPARγ直接结合

. 抗PD-1疗法诱导的细胞死亡所产生的氨会增加Treg的数量并导致免疫治疗耐药

临床数据显示，使用抗PD-1/PD-L1进行免疫治疗后，Treg数量增加。因此作者推测免疫治疗可能会促进肿瘤内部Treg的富集，接受抗PD-1治疗的HCC患者样本证实了这一猜测，组织中氨含量升高，Treg浸润增加（图10A）。在多种肿瘤细胞系中诱导细胞凋亡的结果表明，细胞死亡会提高上清液中的氨浓度，代谢组学分析显示，这种凋亡相关的氨主要来源于转氨脱氨作用（而非谷氨酰胺分解），即谷氨酸在谷氨酸脱氢酶GLUD1作用下生成α-酮戊二酸并释放氨，临床抗PD-1治疗样本的分析结果与细胞一致（图10B-D）。

在Hep-53.4细胞皮下移植肝癌小鼠模型中，抗PD-1治疗初期能抑制肿瘤生长，但随后出现耐药，并伴随着瘤内氨和Treg水平升高。此时，联合使用谷氨酰胺酶抑制剂CB-839无法克服耐药，但联合使用GLUD1抑制剂R162却能有效控制肿瘤的再生长，有效地降低了肿瘤内的氨水平，Treg数量减少（图10E-G）。PD-1耐药的肿瘤中α-KG水平升高，这反映了转氨脱氨基作用的激活，而这一现象通过谷氨酰脱氢酶抑制得以逆转（图10H）。相比之下，谷氨酸水平相对保持不变（图10I）。在Hep-53.4细胞原位肝癌小鼠模型中也观察到了类似的效果。R162联合抗PD-1治疗能有效抑制肝癌进展，并降低肿瘤内氨水平和调Treg浸润，与仅使用R162的组相比治疗效果更为显著（图10J–N）。

图10. 抗PD-1疗法诱导的细胞死亡所产生的氨会增加Treg的数量并导致免疫治疗耐药

综上，该研究首次阐明了氨在Treg适应性免疫抑制中的核心作用，靶向肿瘤的氨生成可以有效降低肿瘤微环境氨水平、削弱Treg功能，从而与现有免疫疗法产生协同作用，为提出了潜在的联合治疗方案奠定了坚实的理论基础，为理解肿瘤免疫逃逸机制提供了新视角，也为抗肿瘤免疫治疗提供了新靶点。