IF= 33.2丨高三尖杉酯碱抑制急性髓系白血病机制

2025年10月30日，北京大学药学院曾克武与屠鹏飞团队在《iMeta》期刊上发表题为“Homoharringtonine suppresses acute myeloid leukemia progression by orchestrating EWSR1 phase separation in an m6A-YTHDF2-dependent mechanism”的研究论文。该研究阐述了传统用于治疗慢性髓系白血病（CML）的药物高三尖杉酯碱（HHT）的全新作用机制：它通过驱动EWSR1蛋白发生液-液相分离，进而以m6A-YTHDF2依赖性方式抑制急性髓系白血病（AML）的进展。值得注意的是，在本研究中，作者使用了汉恒生物提供的lenti-shEWSR1敲低慢病毒及其对照慢病毒，成功构建了NB4细胞稳转株，为后续机制研究奠定了可靠基础。

AML是一种起源于骨髓造血干细胞的恶性血液肿瘤，其特征是骨髓中异常白血病细胞的快速增殖，并因分化成熟受阻而抑制正常造血功能，通常病情进展迅猛、预后较差。在临床治疗中，尤其是急性早幼粒细胞白血病（APL）亚型，三氧化二砷联合全反式维甲酸已成为标准疗法。然而，针对其他更为复杂的AML亚型，目前仍多依赖联合化疗方案。研究表明，当HHT与砷剂及全反式维甲酸联用时，可产生显著的协同抗白血病效应。不过，HHT在AML中的作用靶点尚未完全明确。通过评估HHT相关靶基因的表达水平，有望识别出对HHT治疗更敏感的AML患者亚群。

本文通过蛋白质组学与生物物理学方法，鉴定出EWS RNA结合蛋白1（EWSR1）是HHT的关键作用靶点，并阐明HHT通过结合EWSR1促进其寡聚化及液-液相分离（LLPS），进而招募m6A识别因子YTHDF2，干扰m6A依赖的mRNA降解过程，最终破坏白血病细胞稳态、抑制AML增殖的作用机制。该研究提示HHT可作为靶向EWSR1的小分子药物，为EWSR1高表达的AML患者提供了精准治疗的新方向。

下面，我们一起来了解具体的研究内容：

1.EWSR1被鉴定为AML中HHT的细胞靶点

为明确高HHT的直接作用靶点，作者使用生物素标记的HHT探针筛选人类蛋白质组微阵列，并以信噪比（SNR > 3）量化结合信号，初步获得42个高置信度候选蛋白。进一步结合同位素标记定量蛋白质组学分析，发现EWSR1在所有候选蛋白中富集最为显著，提示其为HHT的关键潜在靶标。临床数据分析显示，EWSR1在AML患者中呈显著高表达且与不良预后相关。此外，EWSR1蛋白水平与HHT的半数抑制浓度（IC50）呈负相关，表明EWSR1高表达的AML患者可能对HHT更为敏感，这提示EWSR1表达与AML细胞对HHT的治疗反应存在潜在关联。

图1. EWSR1被鉴定为AML中HHT的细胞靶点

2.EWSR1的RNA识别结构域介导HHT结合

为验证HHT与EWSR1之间的相互作用，作者采用表面等离子共振（SPR）与微量热泳动（MST）技术，证实二者具有显著的结合亲和力。为进一步明确结合区域，作者将EWSR1蛋白分为N端区域（氨基酸1-300）与C端区域（氨基酸301-656，含RNA识别结构域）。下拉实验显示，HHT特异性结合于EWSR1的C端区域；随后的MST与SPR实验进一步证实，HHT与EWSR1-C端存在特异性相互作用。这些结果共同证明，EWSR1的RNA识别结构域是HHT结合的关键区域。

图2. HHT结合EWSR1的RNA识别结构域

3.HHT通过氢键与EWSR1的RNA识别基序结合

为深入解析HHT与EWSR1的结合机制，作者合成了HHT光亲和标记探针（HHT-PAL），并聚焦于EWSR1-C端（尤其是RNA识别基序）进行研究。实验显示，HHT-PAL与EWSR1-C在紫外照射下发生共价交联，经液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定出两个分子量增加的特定肽段，其交联位点位于EWSR1的RNA识别基序（353–453）内。

分子对接进一步发现，HHT可与EWSR1的T393、P396、M397和I400残基形成氢键，并与H399存在π-π堆叠作用。后续作者构建了EWSR1-C单点及多点突变体，并通过MST与下拉实验验证：T393A、P396A、I400A及Mut4突变体的结合能力显著降低，而M397A突变体与野生型结合力相当。该结果证实T393、P396与I400是HHT在EWSR1 RRM结构域中的关键结合位点，且HHT可能通过多重氢键与EWSR1结合，进而调控下游信号通路。

图3. HHT通过氢键与RNA识别基序相互作用

4.HHT促进EWSR1蛋白的液滴形成

前期研究提示EWSR1易于发生液-液相分离并在细胞内形成蛋白凝聚体。作者通过生物信息学分析发现，EWSR1的N端转录激活域及C端富含RGG的区域均属于内在无序区域。过表达GFP标记的EWSR1后，可在细胞内观察到动态斑点，荧光漂白恢复（FRAP）显示其在80秒内出现荧光恢复，且斑点可发生融合；经1,6-己二醇处理后斑点数量显著减少，证实其具有液态特性。进一步利用光诱导相分离系统（融合光敏蛋白Cry2）证明，EWSR1-N与EWSR1-C均能形成液滴。FRAP实验发现，HHT处理可显著降低EWSR1及EWSR1-C液滴的荧光恢复速率，并促进EWSR1-C凝聚体的形成，提示HHT可能在体外驱动EWSR1-C的构象转变与相分离进程。

图4. HHT促进EWSR1蛋白的液相分离

5.HHT 通过变构机制促进EWSR1相分离

为阐明HHT调控EWSR1相分离的分子机制，作者构建了基于双分子荧光互补（BiFC）的报告系统，将荧光蛋白片段VN173与VC155分别融合于EWSR1-C端，获得EWSR1-VN与EWSR1-VC载体。共转染后，EWSR1可通过自相互作用重建荧光，证实其能形成同源二聚体或寡聚体；而HHT以浓度依赖的方式增强该相互作用。色氨酸荧光分析显示，HHT可降低EWSR1-C的荧光强度，提示其诱导蛋白构象变化。圆二色谱分析进一步表明，随HHT浓度升高，EWSR1-C的α-螺旋含量降低，可能促进蛋白聚集。氢-氘交换质谱（HDX-MS）分析发现，HHT显著提高了两条关键肽段（NKRTGQPMIHIYL与FAWRTECNQ）的氘交换速率，其中NKRTGQPMIHIYL肽段对RNA识别及HHT结合至关重要。综上，HHT可通过变构效应促进EWSR1寡聚化，进而加速其相分离与液滴形成。

图5. HHT通过变构调节促进EWSR1相分离

6.HHT增强EWSR1-YTHDF2相互作用以抑制m6A识别

接下来，作者通过蛋白质组学分析及免疫共沉淀（Co-IP）实验，鉴定出EWSR1的底物蛋白YTHDF2，且两者表达呈正相关。体外实验表明HHT能够增强EWSR1的C端区域与YTHDF2 的YTH结构域相结合，分子对接也支持这一结论。鉴于YTHDF2在识别并降解m6A修饰RNA中的关键作用，作者推测EWSR1相分离可能通过募集YTHDF2干扰其正常功能。实验证实，在HHT作用下，EWSR1可作为YTHDF2介导的m6A识别的负调控因子。此外，m6A点杂交实验及时序分析发现，HHT处理使细胞整体的m6A水平呈浓度和时间依赖性升高，这可能是由于YTHDF2功能被破坏后，m6A修饰的RNA无法被有效降解而导致积累。这些结果共同表明，EWSR1是HHT调控YTHDF2 m6A识别功能的核心靶点。

图6. HHT增强EWSR1-YTHDF2相互作用，限制m6A识别

7.HHT通过EWSR1-YTHDF2轴稳定m6A修饰的转录本

基于EWSR1参与RNA代谢的已知功能，作者在NB4细胞中进行了系列实验。RNA测序显示，HHT处理引起6036个基因上调和5862个基因下调，差异基因富集于线粒体自噬等通路；而在EWSR1敲低细胞中，检测到2121个基因上调和1421个基因下调。对比发现，HHT处理组与EWSR1敲低组共有2872个基因的表达变化重叠，进一步支持EWSR1是HHT的功能靶点。同时，HHT处理后多个TNFRSF家族基因显著上调。甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）显示，m6A修饰上调的基因富集于TNF通路，而下调的m6A修饰基因则与自噬和AMPK信号通路相关。qRT-PCR结果进一步表明，HHT能抑制TNFRSF1B和HMOX1 mRNA的降解，并减少它们与YTHDF2的结合。这些发现提示，HHT通过增强EWSR1-YTHDF2互作，抑制YTHDF2对m6A修饰靶基因（如TNFRSF1B和HMOX1）的识别与降解，从而促进白血病细胞凋亡。

图7. HHT通过EWSR1-YTHDF2轴调节m6A修饰RNA的稳定性

8.EWSR1作为体内急性髓系白血病（AML）的治疗靶点

最后，作者构建了稳定敲低EWSR1的NB4和Kasumi-1细胞系，并将其移植至NOD/SCID与NOG免疫缺陷小鼠中建立AML模型。通过流式细胞术与生物发光成像（BLI）动态监测白血病进展，并给予HHT治疗（0.5 mg/kg，尾静脉注射，持续4周）。结果显示，在对照组小鼠中，HHT能有效抑制白血病进展并显著延长小鼠生存期；然而在EWSR1敲低模型中，HHT未能进一步抑制疾病或延长生存期，说明EWSR1是HHT发挥疗效的必要条件。小鼠存活曲线亦表明，HHT治疗与EWSR1敲低均可显著延长其生存期，但二者联合并未产生叠加效应。综上所述，该研究在体内水平证实EWSR1是HHT抗AML作用的直接靶点。

图8. 用HHT靶向EWSR1抑制AML体内进展

总结

综上所述，本研究确立了EWSR1作为HHT治疗AML的关键靶点，揭示了HHT通过调控EWSR1液-液相分离抑制AML进展的分子机制，并进一步阐明了EWSR1-YTHDF2-m6A轴在AML发生发展中的重要调控作用。这一发现不仅为HHT的临床应用提供了直接机制依据，也为针对不同遗传背景的AML患者开发靶向EWSR1的精准治疗策略提供了新思路。