细胞自噬系列3丨自噬关键分子ATG家族的故事

在前几期的干货中，小恒主要为大家介绍了自噬通路中及WIPI家族基因，这个家族基因隶属于大名鼎鼎的ATG家族。而ATG家族的其他成员们在自噬通路中又扮演了什么角色呢？在接下来的两期，我们将为大家介绍这一庞大家族在细胞自噬中的功能与机制。

一、ATG的发现与功能

自噬过程由一系列进化保守的基因介导，这些基因被统称为自噬相关基因（Autophagy-related gene, ATG）。上世纪90年代,大隅良典实验室利用酵母作为模式生物，通过在营养饥饿条件下进行系统的遗传筛选，首次鉴定出十余个控制自噬过程的关键基因，并将其命名为ATG。随后的十几年间，研究人员逐渐鉴定出40余个ATG成员，这些基因协同调节细胞稳态，在细胞自噬和其他生理过程中发挥重要作用。根据Beth Levine与Guido Kroemer合作在Cell发表的论文，已知ATG家族蛋白的基本功能远不止于经典的自噬过程，其广泛参与包括：自噬溶酶体降解途径；LC3相关的细胞吞噬；非常规分泌性蛋白质、炎症介质等分泌；颗粒/溶酶体分泌的胞吐作用；外泌体分泌；以及依赖于逆运复合体的囊泡运输等膜动态过程。此外ATG蛋白还参与了病原体复制过程、细胞死亡途径、细胞周期调控和先天免疫信号传导等其他关键细胞事件^1,2。

其中，参与自噬溶酶体降解途径是ATG最为重要的功能。已知约有16-20个核心ATG蛋白直接参与该通路的执行，根据不同功能，ATG蛋白家族可被分为多个功能复合体，主要包括：ATG1蛋白激酶复合体、ATG9复合体、磷脂酰肌醇3-激酶PI3K复合体和ATG5/12/16复合体等^3,4。接下来，小恒将以自噬溶酶体降解过程中各核心复合体的参与顺序，为大家逐一解析在自噬通路不同阶段发挥关键作用的ATG基因家族成员。

图1. 自噬信号转导通路（2025 © Cell Signaling Technology）

二、基因详解

1.ULK1/Atg1复合物——自噬起始调控

自噬的启动依赖于ULK1/2激酶复合物的激活，这一复合物在哺乳动物中则一般由ULK1（或ULK2）和ATG13、FIP200（又称RB1CC1，ATG17）、ATG101组成；在酵母中对应为Atg1、Atg13及Atg17-Atg29-Atg31复合物组成。该复合体作为自噬通路中的关键信号换能器，负责整合上游能量感应通路（如mTOR与AMPK）的信号，并启动下游自噬体形成过程。在自噬启动阶段，ATG13与FIP200-ATG101复合体预组装形成一个平台，进而招募ULK1形成完整复合物，该复合物被上游信号激活后从胞浆中易位并富集到自噬体形成位点（Phagophore Assembly Site，PAS），由此启动下游事件。其中，ULK1作为催化核心分子，已在多项研究中被用于鉴定上游调节激酶，识别调控自噬通路的下游底物，并被视为潜在的自噬调节药物靶点。

ATG13（autophagy related 13）作为一个关键的支架蛋白，将ULK1与FIP200连接起来以维持复合物的结构稳定性和激酶活性，是ULK1的直接作用底物和调控因子5。在结构上，ATG13可分为两个区域：N端为球状结构域，包含HORMA（Hop1、Rev7和Mad2）折叠，负责与ATG101相互作用并用于招募ATG14；C端为一个较长的内在无序区域（IDR），包含两个FIP200结合区和一个与ULK1 C端EAT/tMIT结构域结合的基序。此外，ATG13的中间区域包含多个磷酸化位点，这些位点在营养状态变化时被磷酸化或去磷酸化，动态调节其与ULK1和FIP200的结合能力6。在营养充足条件下，ATG13被TORC1高度磷酸化，抑制其与ULK1和FIP200的互作，负向调节ULK1激酶活性，从而抑制自噬；而在饥饿条件下，ATG13发生去磷酸化，并通过其中间区域与ULK1和ATG17相互作用，促进复合物组装，诱导ULK1向PAS的募集及ULK1的二聚化和激活。

FIP200（focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kDa，RB1CC1）即200 kDa黏着斑激酶家族相互作用蛋白，早期研究发现其与FAK激酶结合并抑制其激酶活性，后续进一步研究中将其鉴定为酵母Atg17的哺乳动物同源物^7,8。人FIP200基因编码一种200kDa的蛋白质，结构包含一个二聚化的N端结构域、一个IDR、一个线圈（CC）区域和一个包含亮氨酸拉链基序的C端“爪”结构域。N端结构域二聚体支撑ULK1复合物的组装，C端爪结构域可与NDP52、p62、TAX1BP1等运货受体（cargo receptor）相互作用，从而将ULK1复合物招募至特定细胞位置，此外也可通过与ATG16L1直接相互作用调节自噬体形成^9–11。在III类磷脂酰肌醇-3激酶复合物PI3KC3-C1存在下，ULK复合物与PI3KC3-C1形成超复合物，使得ULK1在FIP200支架上完成二聚化，形成自噬的结构机制。在酵母中，一个Atg13与不同的Atg17二聚体中的两个Atg17结合，这种结合模式可形成高阶组装，诱导Atg1复合物的液-液相分离，促进Atg蛋白聚集并组织自噬体形成位点；而哺乳动物中，一个ATG13与同一FIP200二聚体内的两个FIP200结合，无法诱导ULK复合物的高阶组装，这代表可能存在其他潜在机制实现相分离12。近年研究表明，内质网表面的钙瞬变可诱导FIP200的液-液相分离，形成易于融合的小滴状结构，触发自噬体形成位点¹³。

此外，在线粒体自噬中，FIP200介导了ULK1激酶复合物向线粒体的特异性募集，并在后续自噬阶段中通过自身磷酸化修饰调节下游过程⁸。

ATG101（autophagy-related protein 101）是一个高度保守的的自噬调节蛋白，在除酿酒酵母外的大多数真核生物中，其作为ULK/Atg1复合物的必需亚基代替了酵母系统中的Atg29和Atg31。人ATG101基因编码一个218个氨基酸的蛋白，该蛋白整体为一个典型的HORMA结构域，通过这一结构域与ATG13形成异二聚体，保护ATG13免受蛋白酶体降解，维持ULK1复合物稳定性^14,15。此外，ATG101可通过C端区域与PI3KC3复合物相互作用，以及通过Trp-Phe（WF）指区与其他下游因子相互作用来确保准确的自噬诱导信号传导¹⁶。

图2. ULK1复合体模型¹⁷

2.III型PI3K复合物——膜成核

III型磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3k）通过磷酸化磷脂酰肌醇产生磷脂酰肌醇3磷酸（PI3P）是自噬起始过程中的早期事件，PI3P可招募下游效应蛋白，介导自噬特异性膜运输与成核（nucleation）过程，为自噬泡的形成奠定基础^18,19。PtdIns3k至少形成两种不同的复合物，称为I型复合物和II型复合物（PI3KC3-C1和C2），这两种复合物都包含催化亚基PIK3C3（酵母Vsp34的哺乳动物同源体）、识别蛋白激酶PIK3R4（酵母Vps15的哺乳动物同源体）和Beclin1（酵母Atg6的哺乳动物同源体），此外PI3KC3-C1还包含Atg14L，PI3KC3-C2还包含抗紫外辐射相关基因UVRAG。PI3KC3-C2与UVRAG共同促进内体和自噬体的成熟；而PI3KC3-C1复合物负责在隔离膜上产生PI3P，募集WIPI蛋白，驱动膜延伸²⁰。在此复合物中我们将介绍ATG14和Beclin1这两种重要的ATG蛋白家族成员。

Beclin1是哺乳动物中首个被鉴定的自噬相关基因，作为酵母Atg6的哺乳动物同源基因，在PI3KC3复合物中的发挥核心支架作用。自噬启动时，Beclin1受活化的ULK1磷酸化修饰，增强了与VPS34、VPS15和ATG14L的结合作用，促进PI3K III复合体的组装和激活，通过与其他几种蛋白质相互作用来执行其自噬和膜运输功能。人BECN1基因编码一种450个氨基酸的蛋白质，包含三个重要功能区域：N端为具有多个磷酸化位点的无序区域，以及与BCL-2蛋白相互作用所需的BCL-2同源-3（BH3）结构域，而BCL-2通过与该结构域结合限制Beclin1参与形成C1和C2的水平，从而抑制自噬；中段为可与UVRAG或ATG14的CC结构域相互作用的卷曲（CC）结构域，通过这一结构域可实现与UVRAG或ATG14竞争性结合导致形成相对更稳定的二聚体，通过变构调节相关的脂质激酶活性；C端为与膜结合的β-α自噬特异性（BARA）结构域，CC结构域的C端和BARA结构域之间的部分重叠区域被称为ECD，ECD/BARA区域构成与VPS34结合及膜定位的关键界面^21–24。除了BCL-2家族（如BCL-2、BCL-XL等）的互作调节外，其他众多因子可通过Beclin1的磷酸化来影响自噬：Unc-51样激酶1（ULK1）、AMP活化蛋白激酶（AMPK）可磷酸化Beclin1无序区相应位点诱导自噬体的成核；致癌激酶BCR-ABL激酶通过磷酸化ECD/CC结构域的Y233和Y352位点来抑制自噬；泛素化过程中，如E3连接酶TRAF6、TRIM50可通过Beclin1的泛素化增强自噬水平；在蛋白水解裂解过程中，凋亡半胱天冬酶对Beclin1的裂解也可导致其功能失活，诱导自噬水平下降²⁵。

ATG14（autophagy related 14）也称beclin-1相关自噬相关关键调节因子（Barkor）或ATG14L，是PI3KC3-C1的特异性自噬亚基，通过调节PI3KC3-C1复合物的细胞亚定位来引导其发挥作用。在结构上，ATG14在N端区域含有富含半胱氨酸的结构域和三个卷曲螺旋结构域，这些结构域负责ATG14的核心功能，即桥接PIK3C3和Beclin1，以及将PI3KC3-C1复合物靶向至PAS；C端具有一个Barkor/Atg14(L)自噬体靶向序列（BATS）结构域，可感知膜曲率，并通过两亲性α螺旋的疏水侧与膜结合，从而将复合物锚定到膜特定位置上游激酶对PI3KC3-C1复合物的磷酸化也反应在ATG14上，ATG14在饥饿或缺氧期间可促进ULK1复合物对Beclin1 S15或S30的磷酸化促进自噬；ATG14L中的多个丝氨酸/苏氨酸残基可被mTOR磷酸化，残基突变为丙氨酸则增加PI3K和自噬活性^25–27。此外，ATG14在自噬的早期成核阶段之外也具有非PI3KC3-C1功能，它与t-SNARE复合物（STX17和SNAP29）和SNARE效应蛋白Snapin相互作用，促进自噬体-溶酶体融合过程和内吞运输活性²⁸。

图3. 哺乳动物PI3KC3-C1复合物的结构¹⁹

3.ATG9/ATG9A转运系统——膜供给

哺乳动物细胞中的自噬体直径可达500-1500 nm，体积显著大于与经典的单膜转运囊泡（直径30-80 nm）²⁹。而自噬体膜富含脂质，其生物合成需要大量的脂质供应，供应来源包括内质网、高尔基体、线粒体等多种细胞器的脂质递送。在将这些膜源运输至生长中的自噬体的过程中，ATG9系统承担了关键的转运功能。ATG9是ATG核心蛋白中唯一的跨膜蛋白，在脊椎动物中进化出ATG9A（autophagy related 9A）和ATG9B（autophagy related 9B）两个旁系同源基因，它们都可形成同源三聚体，并作为脂质扰乱酶参与膜脂在脂双层中的重新分布，或是通过囊泡递送脂质修饰酶以改变隔离膜的脂质组成，促进自噬体膜的形成与扩展。ATG9A是功能明确且分布广泛的核心自噬蛋白，是研究基础自噬机制的首选对象；ATG9B则具有表达组织特异性，在胎盘和垂体中表达较高，在特定组织或应激条件下可补偿ATG9A的功能缺失³⁰。

ATG9A是自噬体形成所需的唯一跨膜蛋白，定位于小囊泡，作为脂质扰乱酶充当自噬和囊泡运输的调节剂，促进自噬体或囊泡膜的扩张。其结构可划分为三个主要区域：N端包含短的无义序列和分选基序，用于识别外壳衔接蛋白和磷酸化位点；C末端整体是无序肽段，其末端有一个HDIR（HORMA结构域相互作用区），其对于ATG9A与HORMA结构域蛋白ATG13和ATG101的相互作用至关重要；ATG9A中央区包括大约500个氨基酸，ATG9A形成的同源三聚体，每个原聚体都包含22个α螺旋和4个β链，通过跨膜螺旋的结构域交换组装而成，具有内部孔和空腔分支网络，包括一个亲水性中心孔、三个侧孔和三个垂直孔，这种复杂的空腔结构在膜中形成漏斗状溶剂池，使得磷脂在双膜脂质小叶之间的运动，从而实现其脂质扰乱功能^31–33。

在大自噬起始阶段，ATG9A囊泡与组装完成的ULK复合物相互作用，ATG9A先于ATG13异位至内质网，并在omega体上产生磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）以募集ATG13，两者在内质网延伸、omega体上的相互作用催化隔离膜的形成。有研究表明，在p62依赖性自噬或NDP52依赖性线粒体自噬过程中，ATG13-ATG101可以不依赖ULK结合ATG9A，这代表ATG9A可介导非经典起始调控路径。在衍生阶段，ATG9A囊泡作为隔离膜的“种子膜”，ATG9A可接受脂质实现自噬体的延伸，或恢复隔离膜上的脂质失衡。脂桥转运蛋白可与ATG9A相互作用，将脂质从供体膜直接转移至受体膜，例如，ATG9A的中央孔和侧支旁近位点可与脂桥转运蛋白ATG2A的C末端结合，而ATG2A介导的含PI3P膜结构间的脂质转移受到酵母Atg18/21的哺乳动物同源物WIPI4的刺激，这类相互作用共同增强了复合物的膜拴系能力和脂质转移^34,35。在膜闭合阶段，ATG9A被证明可与IQGAP1相互作用招募内体分选复合物ESCRT-III，通过类质膜修复的机制促进自噬体的闭合。在PINK1-Parkin介导的线粒体自噬中，ATG9A囊泡和ULK1/FIP200由运货受体独立募集到受损线粒体上，触发隔离膜形成，最终包裹受损细胞器形成自噬体⁸。除了自噬功能外，ATG9A在质膜修复、囊泡运输、趋化迁移和细胞器稳态中也起着至关重要的作用³⁶。

ATG9B的结构与酵母同源物更为相似，但与ATG9A相比C末端较短且缺乏HDIR，这表明ATG9B可能不与ATG13-ATG101结合，或存在其他互作机制；而ATG9B的N末端比ATG9A更长，并含有富含脯氨酸的重复区，该结构可能参与核糖体停滞等调控过程³⁷。一项研究发现小鼠肝细胞的Atg9b敲低降低了LC3脂化水平和自噬斑点数；在另一项研究中，人HEK293A细胞中ATG9B的表达能够挽救ATG9A基因敲除细胞中SQSTM1的异常积累³⁰。这些研究表明ATG9B与ATG9A之间相似的结构使得这两个基因功能存在重叠，但目前关于ATG9B的研究较少，其在ATG9A功能冗余之外是否具有独特生理角色仍不清楚。

图4. Atg9囊泡参与自噬体生物发生的起始³⁸

4.Atg12-ATG5泛素样结合系统——膜延伸闭合

隔离膜中的PI3P的产生可招募效应子WIPI2，WIPI2通过将E3-连接酶（ATG12-ATG5-ATG16L1）复合物募集到隔离膜中，诱导ATG8蛋白（LC3和GABARAPLs）与PE，组装成蛋白支架以促进自噬中的隔离膜扩展衍生³⁹。在这个过程，ATG12-ATG5-ATG16L1和ATG8/LC3/GABARAP系统构成了泛素样共价偶联系统，在膜的延伸、弯曲以及闭合中起到了关键作用⁴⁰。虽然ATG12-ATG5-ATG16L1复合物本身并不直接参与膜的弯曲或封闭，但它扮演着类似于E3泛素连接酶的角色，将E2结合酶（LC3-ATG3）和底物（自噬体膜上的PE）在空间上拉近，促进LC3从ATG3向PE的转移，对于LC3/ATG8-PE系统的运行十分重要。

ATG12（autophagy related 12）是一个类泛素蛋白，促进膜的延伸闭合以形成自噬小体。人源ATG12蛋白由140个氨基酸组成，在结构上，ATG12包含N端的一段内源性无序区（IDPR），泛素样结构域（YBL）和一段无序序列。在酵母中，IDPR区域与UBL结构域相邻对于其与Atg7和Atg10的结合至关重要，也可保护Atg12的C端免受蛋白酶降解。ATG12的一级结构与泛素（Ub）蛋白并没有同源性，但是ATG12存在泛素超折叠结构以及形成异肽键C端的甘氨酸。在ATG12系统中，泛素样蛋白ATG12的C端甘氨酸被E1样酶ATG7以ATP依赖的方式激活，依次与ATG7和E2样酶ATG10形成硫酯中间体，最终通过异肽键与ATG5的受体赖氨酸残基结合，此外，Atg12还与Atg5形成疏水和亲水性相互作用，从而固定其在Atg5上的位置^41,42。两组ATG12-ATG5偶联物与ATG16(L)二聚体形成复合体，并作为ATG8家族的E3酶促进Atg8与膜脂质磷脂酰乙醇胺（PE）的头基结合⁴³。

ATG7（autophagy related 7）是一种同源二聚体E1样酶，在自噬中可激活两条泛素样修饰通路。在结构上，ATG7包含N端结构域（ETD）和C端结构域（CTD）⁴⁴。NTD负责结合E2（Atg3、Atg10），从而将ATG8转移至ATG3或将ATG12转移至ATG10；CTD中包含三个重要结构域，具有ATP结合位点的腺苷化结构域（AD）负责结合和催化ATP与ATG12或ATG8的C末端甘氨酸形成高能硫酯键，催化半胱氨酸结构域（CL）负责接收被激活的ATG12或ATG8以形成短暂的中间体，C端结构域（ECTD）负责识别和捕获底物。ATG7可分别驱动ATG8或ATG12腺苷化，消耗ATP与二者形成硫酯中间体（如ATG7-ATG12），随后将它们转移到两个同源的E2酶ATG3或ATG10上。作为自噬机制的一部分，ATG7除了参与降解途径，也参与调控细胞凋亡与坏死的转换^45,46。此外，研究还发现了一种缺乏E1样酶活性的ATG7同工型，该变体无法对ATG8同源蛋白进行脂化修饰，这一同工型生物学功能尚不明确，但它可能通过破坏功能性ATG7同源二聚体的形成来负向调控自噬过程⁴⁷。

ATG10（autophagy related 10）负责承接由ATG7激活的ATG12并将其最终递送至ATG5，是介导ATG12与ATG5连接的E2样结合酶⁴⁵。在结构上，ATG10呈现典型的E2酶样折叠（UBC折叠），该结构由一个四链反平行的β-折叠片层和围绕在其周围的几个α-螺旋组成，在相对灵活的催化环结构上存在一个保守的半胱氨酸残基，在UBC核心结构域的C端有一个额外的α-螺旋结构域⁴⁸。在自噬流中，ATG10的半胱氨酸残基亲核攻击ATG7-ATG12的硫酯键，将ATG12被转移到ATG10上，同时释放出ATG7；当ATG10-ATG12复合物与ATG5正确定位后，由ATG5攻击ATG10-ATG12中的硫酯键形成酰胺键，生成稳定的ATG12-ATG5共价复合物并释放ATG10。ATG10的活性半胱氨酸被释放出来，恢复到自由状态，可以重新回到第一步，参与下一轮的催化循环⁴⁹。

ATG5（autophagy related 5）是一个泛素样蛋白，负责促进LC3-PE酰胺键形成和自噬体的膜延伸。人类ATG5由275个氨基酸组成，主要由N端和C端两个串联的、结构上类似的泛素样结构域（Ubl）和一个富含螺旋结构域的铰链区构成，这三个结构域融入了ATG5独特的整体结构，与其他蛋白进行相互作用。N端Ubl结构域主要负责与ATG16L1的相互作用；C端Ubl结构域负责与ATG3相互作用；位于连接两个Ubl结构域的柔性铰链区域附近的共价修饰位点Lys130可与ATG12发生G-Cter共价结合，形成ATG12–ATG5共轭体^50,51。ATG5是ATG12唯一的共价修饰靶标，由此形成的ATG12-ATG5异源二聚体是一个具有下游功能的活性单位，可被ATG16L1特异性地识别并进行非共价结合，组装为ATG12-ATG5-ATG16L1复合物。复合物定位于隔离膜后，ATG5可通过C端Ubl结构域捕获并定位携带LC3的ATG3。此外，在ATG16L1缺失的情况下，位于溶酶体膜上的TECPR1（结合PtdIns（4）P的溶酶体蛋白）可招募ATG5-ATG12复合物中的ATG5，结合组装成ATG12-ATG5-TECPR1类E3复合物，调控非典型LC3脂质化，介导自噬体-溶酶体融合或修复损伤的溶酶体膜^52,53。

ATG16L1（autophagy related 16 like 1）是酵母Atg16的功能性哺乳动物同源物，主要负责下游靶隔离膜的识别和锚定⁵⁴。人源ATG16L1蛋白由607个氨基酸组成，包含三个主要结构域：N端ATG5结合域可与ATG5蛋白特异性结合；中段的卷曲螺旋结构域（CCD）可驱动两个ATG16L1分子寡聚化形成同源二聚体，促使ATG12-ATG5-ATG16L1单元组装成最终的四聚体，此外，这一区域也可结合WIPI2和Rab33调节自噬体膜的延长；C端WD40重复结构域识别早期自噬膜上的PIP3和WIPI2，实现膜识别和靶向结合，并可能参与炎症控制和病原体清除等过程55–57。ATG16L1介导ATG12-ATG5复合物到隔离膜的招募，并将两个共价偶联系统固定至膜上，使LC3在该位点发生脂化，进而促进隔离膜的伸长、闭合，最终形成自噬体和自噬溶酶体。另外，ATG16L1也参与不形成典型双膜自噬体的LC3相关吞噬，例如LAP（LC3相关吞噬作用）时，ATG16L1会被招募至吞噬泡的膜上并驱动LC3的脂化58。另一种哺乳动物同源物ATG16L2与ATG16L1差异集中在中段CCD区，这使得ATG16L2可与ATG12-ATG5形成复合物，但在常规自噬过程中缺乏LC3酯化激活性59,60。近年的研究发现ATG16L2的缺失并不影响自噬流，而它的过表达可能竞争性抑制ATG16L1的作用，但内源性ATG16L2的主要功能依然尚待探究^61,62。

图5. ATG共轭系统⁴³

三、相关的载体现货

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表1. ATG相关基因现货列表

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