STTT | 渡过“流量”反噬危机，Wnt2启动I/R后心脏保护程序，及时止损

下面我们一起来看看作者是如何开展相关的研究：

1. Wnt2与AMI患者心脏I/R损伤呈负相关

为评估Wnt2在心脏I/R损伤中的临床意义，作者观察了68例接受PCI的急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者，发现术后血清中Wnt2水平自第1天至第4天持续下降，并与心肌损伤标志物cTNT和CK-MB呈显著负相关（图1 a-c）。这些数据表明，Wnt2水平降低与心肌I/R损伤程度相关，且可能具有对抗I/R损伤的作用。

图1（a-c）. AMI患者中Wnt2水平降低与I/R损伤加重呈显著相关性

2. 给予rbWnt2处理有效缓解了心脏I/R损伤

接着，进一步探究了Wnt2在I/R损伤中的动态变化及其治疗潜力。通过建立I/R损伤小鼠模型及AMCMs的缺氧/复氧（H/N）模型，并综合采用ELISA、超声心动图、应变分析、Evans Blue/TTC双染及ATP检测进行评估。研究发现，I/R后小鼠血清及心脏Wnt2水平呈进行性下降趋势，且主要局限于缺血区心肌细胞（图1 d-f）。而外源性输注rbWnt2可显著改善I/R后心脏功能，包括提升左心室射血分数（LVEF）和缩短分数（LVFS）、改善舒张功能、增强心肌应变并减轻机械不同步，同时明显减小心肌梗死面积并维持心肌ATP水平（图2）。体外实验进一步证实，rbWnt2可逆转H/N诱导的心肌细胞中Wnt2表达及ATP耗竭（补充图2 f-h）。以上结果表明，在I/R早期阶段补充rbWnt2可产生显著的心脏保护作用。

图1（d-f）. AMI患者中Wnt2水平降低与I/R损伤加重呈显著相关性

图2. rbWnt2给药可显著减轻I/R损伤

补充图2（f-h）. rbWnt2可逆转H/N诱导的心肌细胞中Wnt2表达及ATP耗竭

3. rbWnt2改善心肌I/R损伤时的心肌细胞死亡

为探究rbWnt2是否通过抑制心肌细胞死亡来减轻I/R损伤。作者通过体内外实验结合TUNEL染色、western blot、普鲁士蓝染色及脂质过氧化物检测等分析发现，经rbWnt2处理的心脏能显著减少I/R后心肌细胞凋亡，表现为TUNEL阳性细胞减少、促凋亡蛋白（cleaved caspase-3、Bax）表达下调及抗凋亡蛋白Bcl-2表达恢复，并能抑制由H/N诱导的AMCMs凋亡（图3 a-d）。同时，rbWnt2还能有效抑制心肌细胞铁死亡，表现为显著降低铁沉积、减轻脂质过氧化（丙烯醛、Acsl4、MDA水平下降）并恢复GPX4的表达（图3 e-i）。上述结果表明，rbWnt2可通过特异性抑制I/R诱导的心肌细胞凋亡与铁死亡，在I/R损伤中发挥关键的心肌保护作用。

图3. rbWnt2干预抑制心肌I/R损伤中的细胞凋亡与铁死亡

4. Wnt2通过激活I/R心脏中抗氧化基因的转录以降低ROS水平

为进一步阐明Wnt2减轻心脏I/R损伤的分子机制，作者通过蛋白质组学分析发现，rbWnt2处理I/R小鼠心脏引起大量蛋白的表达差异，KEGG富集分析提示这些蛋白与ROS代谢通路显著相关（图4 a-b）。接着，检测体内外ROS水平变化表明，rbWnt2能有效抑制I/R后心肌组织及AMCMs中ROS的积累（图4 c-e）。在机制上，rbWnt2显著上调了多种ROS清除基因（如Sod1-3、Gpx1/4、Ucp3等）的转录水平，并在蛋白层面验证了Ucp3、Sod1、Sod2和Gpx1的表达恢复（图4 f-h）。这些结果揭示，rbWnt2通过激活抗氧化基因的表达，增强心肌细胞的ROS清除能力，从而恢复氧化还原稳态，缓解I/R过程中的氧化损伤。

图4. rbWnt2通过增强ROS清除基因的转录和表达来缓解氧化应激

5. Wnt2通过下调Nap1L1重新激活I/R损伤心脏中的抗氧化基因转录

随后，作者探讨了Wnt2在I/R损伤中调控ROS水平的具体分子机制。通过蛋白质组学、生物信息学分析及系列功能实验发现，Wnt2的心脏保护作用不依赖于经典的Wnt/β-catenin信号通路（补充图4 a）。关键机制在于，Wnt2显著下调了Nap1L1的表达；而Nap1L1在I/R过程中累积于细胞核和细胞质，并与抗氧化酶（如Ucp3、Sod2）水平呈负相关（图5 a-e）。为验证Wnt2通过下调Nap1L1来减轻I/R损伤诱导的ROS的产生，在体内和体外分别过表达和敲低Nap1L1。主要通过构建Nap1L1敲低腺病毒和心肌特异性Nap1L1敲低腺相关病毒（AAV9-cTnT-shNap1L1），分别实现在AMCMs和小鼠体内心肌细胞特异性敲低Nap1L1的水平，并发现Nap1L1下调可模拟rbWnt2的抗氧化效应，有效降低ROS水平并上调抗氧化基因（Ucp3、Sod1、Sod2和Gpx1）的表达；同样地，通过腺病毒和AAV9-cTnT-Nap1L1分别在AMCMs和小鼠体内心肌细胞中过表达Nap1L1，这阻断了rbWnt2对ROS的抑制及抗氧化蛋白的诱导表达作用（图5 f-k）。进一步机制研究显示，Nap1L1通过与抗氧化反应元件（ARE）结合，抑制下游抗氧化基因的转录；而rbWnt2处理能减少Nap1L1在核内的积累及其与ARE元件的结合，从而恢复ARE介导的转录活性（图5 l-o）。上述结果表明，Wnt2通过下调Nap1L1重新激活抗氧化基因的转录，进而降低I/R损伤后的ROS水平。

补充图4a. rbWnt2以非经典Wnt/β-catenin信号依赖的方式促进ROS清除基因的转录

图5. Wnt2通过下调Nap1L1重新激活I/R心脏中的抗氧化基因转录

6. Wnt2介导Nap1L1下调对细胞凋亡和铁死亡具有双重抑制作用

为明确Nap1L1下调是否介导了Wnt2对I/R后心肌细胞凋亡和铁死亡的双重抑制作用。通过体内外敲低或过表达Nap1L1发现，Nap1L1下调能有效减少凋亡细胞的数量、抑制caspase-3活化，并降低脂质过氧化水平、减少铁沉积、恢复GPX4的表达，其保护效果与rbWnt2处理相当（图6 a-e）。而过表达Nap1L1则消除了rbWnt2的心脏保护作用（图6 f-j）。这些结果表明，Nap1L1下调是rbWnt2减轻氧化损伤、协调心肌保护以对抗心脏I/R损伤中细胞凋亡和铁死亡的关键靶标。

图6. Wnt2通过下调Nap1L1来抑制I/R心脏中的细胞凋亡与铁死亡

7. Nap1L1的调控对于Wnt2在I/R后的心脏保护作用至关重要

接着，进一步明确抑制Nap1L1是否能在Wnt2介导的心脏保护中起关键作用。同样通过体内外过表达或敲低Nap1L1，结合心脏超声、应变分析、梗死面积评估及ATP检测等方法，研究发现Nap1L1过表达本身对基础心功能影响较小，但却能阻断rbWnt2对I/R后心脏功能的改善作用，包括抑制LVEF、LVFS的提升以及应变参数的恢复，并逆转了rbWnt2对梗死面积减少的效果、以及对心肌ATP水平的维持作用（图7 a-c, g, i）。相反，心肌特异性敲低Nap1L1则模拟了rbWnt2的保护效应，显著改善心脏功能、减小梗死面积并维持ATP水平（图7 d-f, h, j）。这些结果共同表明，Nap1L1表达下调是rbWnt2对I/R损伤发挥心脏保护作用的关键机制。

图7. Nap1L1的调控对于Wnt2在I/R损伤后发挥心脏保护作用至关重要

8. rbWnt2通过作用于Lrp6，促使Trim11在I/R响应下介导Nap1L1的降解

最后，作者探究了rbWnt2下调Nap1L1表达的分子机制。评估了rbWnt2处理组与PBS对照组心肌细胞中Nap1L1的泛素化水平，并通过生信分析、co-ip等方法进行验证。结果发现，rbWnt2可逆转I/R引起的Nap1L1泛素化下降；而E3连接酶Trim11被鉴定为其中的关键因子，rbWnt2可特异性上调Trim11的表达并增强其与Nap1L1的相互作用，而敲低Trim11则阻断rbWnt2对Nap1L1泛素化的促进作用（图8 a-e）。进一步研究Wnt2与哪种受体互作在I/R损伤中发挥心脏保护作用，通过STRING数据库和co-ip等分析发现，rbWnt2通过与Lrp6结合，激活下游信号，进而上调Trim11的表达并促进Nap1L1泛素化降解（图8 f-i）。以上结果揭示了一条新的心脏保护信号轴，即Wnt2‑Lrp6‑Trim11‑Nap1L1，其中Wnt2通过Lrp6受体招募Trim11，驱动Nap1L1的泛素化降解，从而在I/R损伤中发挥心脏保护作用（图9）。

图8. rbWnt2通过与Lrp6互作，在I/R条件下促进Trim11介导的Nap1L1泛素化降解

综上，本研究通过临床AMI队列和实验性I/R小鼠模型，首次发现Wnt2作为动态下调因子，与心肌损伤程度呈负相关。并采用多组学与遗传学方法，证实rbWnt2通过一条全新的Lrp6/Trim11/Nap1L1信号轴，抑制ROS诱导的细胞凋亡与铁死亡，从而发挥心脏保护作用。该机制通过介导Nap1L1泛素化降解，解除其对ARE元件的转录活性抑制，进而促进抗氧化基因表达，重建氧化还原稳态。这些发现揭示了Wnt2是区室化氧化应激的核心调控因子，为缺血性心脏病的精准干预提供了突破性的潜在治疗策略。

图9. 机制示意图