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ceRNA 验证服务

ceRNA（competing endogenous RNA，竞争性内源 RNA）机制是近年来非编码 RNA 研究的热点：lncRNA、circRNA、假基因等转录本通过共享 miRNA 反应元件（MRE），像"海绵"一样竞争性吸附 miRNA，从而解除 miRNA 对靶基因的抑制。验证 ceRNA 与 miRNA 的吸附关系，是 lncRNA/circRNA 功能机制研究的核心环节。

ceRNA 机制

细胞内 miRNA 数量有限，当 lncRNA 或 circRNA 上存在某 miRNA 的结合位点时，二者会竞争性结合该 miRNA：ceRNA 分子表达升高会竞争结合更多 miRNA，减轻 miRNA 对靶 mRNA 的抑制；反之，敲低 ceRNA 则释放更多 miRNA 抑制靶基因。这一"海绵"模型（miRNA sponge）是 ceRNA 假说的核心。

ceRNA 分子

lncRNA、circRNA（环状结构更稳定，是海绵研究热门分子）。

共享 MRE

ceRNA 与靶 mRNA 具有相同或相似的 miRNA 结合位点。

miRNA

介导两者竞争关系的核心桥梁。

双荧光素酶验证 ceRNA 互作的原理

将 ceRNA 上的候选 MRE 序列（WT）及结合位点突变体（MUT）插入报告基因 3′UTR 区域，与 miRNA mimic 共转染细胞，以双荧光素酶读出吸附强弱；再叠加 ceRNA 的过表达/敲低，判断竞争方向。

图1：ceRNA 海绵模型。ceRNA 与靶 mRNA 共享 MRE，竞争结合有限 miRNA；ceRNA 升高吸附更多 miRNA 使靶基因去抑制，降低则释放 miRNA 抑制靶基因。

验证原理要点

直接验证（吸附位点）：将 lncRNA/circRNA 上的候选 MRE 序列（WT）及结合位点突变体（MUT）插入报告基因 3′UTR 区域，与 miRNA mimic 共转染细胞。WT 组荧光显著下降而 MUT 组回复，即证明该位点是 miRNA 的直接吸附位点。
方向性验证（ceRNA 网络）：在报告质粒 + mimics 基础上，过表达或敲低候选 ceRNA 分子：过表达 ceRNA 时报告基因活性升高（miRNA 被竞争结合）、敲低时活性降低，即证明 ceRNA 与靶序列间存在对 miRNA 的竞争性结合。
双荧光素酶读出：psiCHECK-2 自带 R-Luc 报告 + F-Luc 内参，单孔完成吸附强弱与转染效率校正，结果可比。

系统基于两类发光机制不同的荧光素酶：萤火虫荧光素酶（F-Luc）与海肾荧光素酶（R-Luc），同一样本中顺序检测，互不干扰。

双证据链：WT/MUT 验证吸附位点 + 方向性验证，两者齐备才是完整的 ceRNA 证据，更易获得审稿认可。

两种验证方式

直接验证（吸附位点）

核心操作: 候选 MRE（WT/MUT）插入报告基因 3′UTR
共转染: 报告质粒 + miRNA mimic
判定: WT 荧光↓、MUT 回复 → 直接吸附位点

方向性验证（ceRNA 网络）

核心操作: 过表达 / 敲低 ceRNA + 报告系统
共转染: 报告质粒 + mimics ± ceRNA
判定: 过表达活性↑、敲低活性↓ → 竞争性结合

报告系统与载体

双荧光素酶报告系统（psiCHECK-2） — 报告基因 3′UTR 插入候选 MRE + miRNA mimic，R-Luc 变化反映吸附强弱

本系统采用 psiCHECK-2 双荧光素酶报告载体（R-Luc 报告 + F-Luc 内参），单质粒即可完成 MRE 吸附读出与转染效率校正：

双报告校正
psiCHECK-2 自带 R-Luc 报告与 F-Luc 内参，单孔完成吸附读出与转染效率校正。
3′UTR 灵活克隆
候选 MRE（WT / MUT）插入报告基因 3′UTR，支持 ceRNA 与靶序列两种设计。
WT/MUT 对照
突变体回复证明吸附特异性，排除非特异性结合，形成完整证据链。

服务内容

服务	说明
lncRNA 吸附 miRNA 验证	lncRNA 候选 MRE（WT/MUT）克隆 + miRNA mimic 共转染验证吸附位点
circRNA 吸附 miRNA 验证	circRNA 成环序列 MRE 克隆验证（环化序列全长或关键片段）
ceRNA 竞争结合验证（方向性）	过表达/敲低 ceRNA + 报告系统，验证 ceRNA-miRNA-靶基因轴
MRE 预测与方案设计	生物信息学预测候选 miRNA 及结合位点，设计突变方案
配套服务	lnc/circRNA 过表达质粒、慢病毒包装、qPCR 与 WB 表达量验证（可组合下单）

实验流程

MRE 预测与方案设计

确定候选 miRNA、结合位点与分组（WT/MUT、过表达/敲低）。

方案评估

报告质粒构建

MRE 序列（WT/MUT）插入报告载体 3′UTR，测序验证确保插入正确。

WT / MUT 并行测序验证

细胞转染

报告质粒 + miRNA mimic（± ceRNA 过表达质粒/敲低试剂）共转染 HEK293T 等。

共转染对照设置

双荧光素酶检测

采用 HB-DLR-100 试剂盒，依次检测 R-Luc / F-Luc 活性，F-Luc 校正转染效率。

HB-DLR-100R / F 双报告

数据分析与报告交付

交付

Fold Change 与统计检验，交付完整原始数据与报告。

原始数据完整报告

应用案例

以下为文献级客户应用案例，点击标签切换查看不同研究方向的应用实例。

LYPLAL1-DT / miR-204-5p / BCL2 ceRNA 验证（小细胞肺癌）实验案例

Molecular Cancer IF 27.7

Overcoming multi-drug resistance in SCLC: a synergistic approach with venetoclax and hydroxychloroquine targeting the lncRNA LYPLAL1-DT/BCL2/BECN1 pathway

ceRNA 靶向验证三步证据链：Fig. 4B 生信预测、Fig. 4D 双荧光素酶、Fig. 4E RIP — Fig. 4B、4D、4E：ceRNA 靶向验证三步证据链：生信预测（5 算法交集锁定 BCL2）→ 双荧光素酶（BCL2 3′UTR WT/MUT + miR-204-5p mimic，WT 活性显著下降、MUT 无变化）→ RIP（BCL2 富集于 Ago2 复合物），证实 miR-204-5p 直接靶向 BCL2 3′UTR。

客户单位

首都医科大学

使用产品

psiCHECK-2 双荧光素酶报告质粒（LYPLAL1-DT WT/MUT、BCL2 3′UTR WT/MUT） miR-204-5p mimics / inhibitors RNAfit 转染试剂 pHBLV-LYPLAL1-DT 过表达 / shRNA 慢病毒

产品信息

psiCHECK-2 双荧光素酶报告载体（R-Luc 报告 + F-Luc 内参，单质粒自带转染校正）；miRNA mimic/inhibitor 用于模拟或抑制 miR-204-5p；pHBLV 慢病毒用于构建 LYPLAL1-DT 稳定过表达/敲低细胞株，供回复实验使用。

使用方式

将 LYPLAL1-DT 全长结合位点及 BCL2 3′UTR 的 WT/MUT 序列分别插入 psiCHECK-2，与 miR-204-5p mimic 共转染 293T 细胞，检测 R-Luc/F-Luc 比值；RIP 验证 BCL2 在 Ago2 复合物中的富集；用 pHBLV 慢病毒建立 LYPLAL1-DT 过表达/敲低细胞株，叠加 miR-204-5p mimic 做回复实验。

研究结论：LYPLAL1-DT 作为 ceRNA 竞争性吸附 miR-204-5p，解除其对 BCL2 的抑制，抑制凋亡、介导小细胞肺癌对顺铂/VP-16/紫杉醇的多药耐药；WT/MUT 双荧光素酶 + RIP + 回复实验构成完整 ceRNA 证据链。

circPTK2 / miR-379-5p / AKR1C3 ceRNA 验证（肝细胞癌）实验案例

Scientific Reports IF 3.8

hsa_circ_0008305 facilitates the malignant progression of hepatocellular carcinoma by regulating AKR1C3 expression and sponging miR-379-5p

ceRNA 双端验证证据链：Fig. 7A RIP、Fig. 7G circPTK2 双荧光素酶、Fig. 8B AKR1C3 3′UTR 双荧光素酶 — Fig. 7A、7G、8B：ceRNA 双端验证证据链：RIP（circPTK2 富集于 Ago2 复合物）→ circRNA 端双荧光素酶（circPTK2 WT/MUT + miR-379-5p mimic，WT 活性显著下降、MUT 无变化）→ mRNA 端双荧光素酶（AKR1C3 3′UTR WT/MUT + mimic，WT 活性显著下降、MUT 无变化），证实 circPTK2 与 AKR1C3 均直接结合 miR-379-5p。

客户单位

南昌大学第二附属医院肿瘤科

使用产品

psiCHECK-2 双荧光素酶报告质粒（circPTK2 WT/MUT、AKR1C3 3′UTR WT/MUT） pHBLV-CMV-circ 过表达慢病毒 pLKO shRNA（sh-circPTK2） pcDNA3.1-AKR1C3 过表达质粒 si-AKR1C3 siRNA

产品信息

psiCHECK-2 双荧光素酶报告载体（R-Luc 报告 + F-Luc 内参），circRNA 端与 mRNA 端各构建 WT/MUT 两套；pHBLV-CMV-circ 慢病毒用于 circPTK2 稳定过表达；pLKO shRNA 用于 circPTK2 稳定敲低；pcDNA3.1-AKR1C3 与 si-AKR1C3 用于靶基因过表达/敲低回复实验。

使用方式

将 circPTK2 结合位点与 AKR1C3 3′UTR 的 WT/MUT 序列分别插入 psiCHECK-2，与 miR-379-5p mimic 共转染 HEK-293T，检测双荧光素酶活性；Ago2 RIP 与 biotin-miRNA pull-down 验证共享 RISC；用 pHBLV/pLKO 建立 circPTK2 过表达/敲低细胞株，叠加 miR-379-5p inhibitor 或 si-AKR1C3 做双向回复实验。

研究结论：circPTK2（hsa_circ_0008305）作为 ceRNA 吸附 miR-379-5p，解除其对 AKR1C3 的抑制，促进肝细胞癌增殖、迁移与侵袭；circRNA 端与 mRNA 端双荧光素酶均验证直接结合，配合 RIP、pull-down 与双向回复实验构成全链条 ceRNA 证据。

circNOX4 / hsa-miR-6884-5p / YWHAG ceRNA 验证（胆管癌）实验案例

Functional & Integrative Genomics IF 3.1

CircNOX4 promotes proliferation and resistance by regulating the hsa-miR-6884-5p/YWHAG Axis and ERK signaling pathway in cholangiocarcinoma

ceRNA 双端验证证据链：Fig. 4D circNOX4 双荧光素酶、Fig. 4I YWHAG 双荧光素酶、Fig. 4E Ago2 RIP — Fig. 4D、4I、4E：ceRNA 双端验证证据链：circRNA 端双荧光素酶（circNOX4 WT/MUT + hsa-miR-6884-5p mimic，WT 活性显著下降、MUT 无变化）→ mRNA 端双荧光素酶（YWHAG WT/MUT + mimic，WT 活性显著下降、MUT 无变化）→ Ago2 RIP（circNOX4 与 miR-6884-5p 均在 Ago2 复合物中富集），证实 circNOX4 与 YWHAG 均直接结合 hsa-miR-6884-5p。

客户单位

山东大学齐鲁医院

使用产品

psiCHECK-2 双荧光素酶报告质粒（circNOX4 WT/MUT、YWHAG WT/MUT）

产品信息

psiCHECK-2 双荧光素酶报告载体（R-Luc 报告 + F-Luc 内参），circRNA 端与 mRNA 端各构建 WT/MUT 两套，覆盖 ceRNA 双端直接结合验证。

使用方式

将 circNOX4 结合位点与 YWHAG 3′UTR 的 WT/MUT 序列分别插入 psiCHECK-2，与 hsa-miR-6884-5p mimic 共转染 HEK-293T，检测双荧光素酶活性；Ago2 RIP 验证 circNOX4 与 miR-6884-5p 在 RISC 中的共富集；叠加 miR-6884-5p mimic 做 YWHAG 蛋白水平与增殖表型回复实验。

研究结论：circNOX4（hsa_circ_0023988）作为 ceRNA 吸附 hsa-miR-6884-5p，上调 YWHAG 并与 RAF1 互作激活 ERK 通路，促进胆管癌增殖并降低 Trametinib 敏感性；circRNA 端与 mRNA 端双荧光素酶 + Ago2 RIP 构成双端直接结合的完整 ceRNA 证据。

常见问题

ceRNA 验证的常规策略是什么？

通常需要两条证据链：① WT/MUT 报告基因实验验证具体吸附位点；② 过表达/敲低 ceRNA 观察方向性变化。两者齐备才构成完整的 ceRNA 证据。

circRNA 如何克隆到载体中？

需克隆 circRNA 的环化外显子序列（包含反向剪接位点），在验证成环后，再插入报告载体进行后续实验。

是否必须设置突变型（MUT）对照？

强烈建议设置。MUT 对照是排除非特异性结合、证明靶向特异性的关键，也是高分文章审稿时的常规要求。

ceRNA 验证和常规 miRNA 靶基因验证有什么区别？

miRNA 靶基因验证旨在证明"miRNA 靶向某特定序列"；而 ceRNA 验证在此基础上，进一步证明"该序列（如 lncRNA/circRNA）能与其他转录本竞争结合同一条 miRNA"。

通常选用哪些细胞系进行检测？

HEK293T 是最常用的工具细胞。此外，建议选择 ceRNA 分子与 miRNA 均有内源表达的细胞系，可配套 qPCR 进行预验证。

能否额外增加表达量检测？

可以。可组合 qPCR 或 WB 实验，验证 ceRNA、miRNA 及靶基因的表达量变化，从而形成“功能表型 + 分子机制”的双重证据。

实验周期通常需要多久？

常规项目周期需根据具体构建复杂度评估，一般在方案确认后提供预计交付时间；具体请咨询技术支持。

ceRNA 验证服务

ceRNA 机制

ceRNA 分子

共享 MRE

miRNA

双荧光素酶验证 ceRNA 互作的原理

验证原理要点

两种验证方式

直接验证（吸附位点）

方向性验证（ceRNA 网络）

报告系统与载体

双报告校正

3′UTR 灵活克隆

WT/MUT 对照

服务内容

实验流程

MRE 预测与方案设计

报告质粒构建

细胞转染

双荧光素酶检测

数据分析与报告交付

应用案例

Overcoming multi-drug resistance in SCLC: a synergistic approach with venetoclax and hydroxychloroquine targeting the lncRNA LYPLAL1-DT/BCL2/BECN1 pathway

hsa_circ_0008305 facilitates the malignant progression of hepatocellular carcinoma by regulating AKR1C3 expression and sponging miR-379-5p

CircNOX4 promotes proliferation and resistance by regulating the hsa-miR-6884-5p/YWHAG Axis and ERK signaling pathway in cholangiocarcinoma