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转录因子和启动子相互作用

启动子相当于“基因开关”,能够控制基因表达的开启和关闭。而启动子的活性受转录因子的调节,转录因子是一种具有调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。一些转录因子仅与其靶基因启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式作用元件,转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因分析(luciferase assay)是检测这类转录因子和其靶基因启动子中的特异顺式元件结合的重要手段。

汉恒生物在转录因子与启动子作用研究中常用到的是报告质粒pGL3-Basic,内参质粒pRL-TK和转录因子表达质粒。将靶基因启动子的特定片段插入到pGL3-Basic载体中荧光素酶编码序列上游作为荧光素酶的启动子序列,再与转录因子表达质粒和内参质粒共转染细胞,裂解后加入特定的荧光素酶底物,通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性,从而判断转录因子是否能与该靶基因启动子片段作用。结合定点突变等方法则可进一步确定转录因子与靶基因启动子的作用位点。


pGL3-Basic与pRL-TK质粒图谱


实验原理:

    验证转录因子与启动子z相互作用最常用的方法便是双荧光素酶验证试验。

    荧光素(Luciferase)是自然界中能够产生生物发光的酶的统称,其中最有代表性的是来自萤火虫 (Firefly) 体内和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶,分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase。

    这两种荧光素酶作用方式不同。一是底物和辅助因子不同,萤火虫荧光素酶需要荧光素、O2、ATP 和 Mg2+,而海肾荧光素酶仅需要腔肠素(coelenterazine)和 O2。二是发光颜色不同,萤火虫荧光素酶产生黄绿色光,发光波长为 560 nm;而海肾荧光素酶产生蓝光,发光波长为 465 nm。常应用于启动子转录活性调控及miRNA靶基因验证等研究。

转录因子与启动子研究服务内容:

启动子活性验证:验证转录因子与启动子是否存在相互作用

转录因子与启动子作用位点研究:通过截短、潜在结合位点突变验证转录因子与启动子的结合位点

转录因子与启动子结合验证服务流程:

其他服务(产品):

1、启动子报告质粒构建

2、miRNA靶基因报告质粒构建

3、单(双)荧光素酶检测试剂盒