前列腺癌（PCa）是男性中发病率位居第二的常见恶性肿瘤，去势抵抗性前列腺癌（CRPC）是疾病进展的晚期阶段，现已成为前列腺癌治疗中最棘手的临床难题之一。对于存在同源重组修复基因（如BRCA1/2）突变的晚期患者，PARP抑制剂（PARPi，如奥拉帕利和鲁卡帕尼）是首选的靶向治疗选择，而当前PARPi的临床疗效往往受到耐药性的限制，耐药机制包括BRCA基因的逆转突变、药物外排泵的上调和DNA修复途径的改变等。环状RNA（circRNA）是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA，可通过充当“分子海绵”吸附miRNA，或与RNA结合蛋白（RBP）相互作用，广泛参与转录后调控，影响包括药物耐药在内的多种癌症表型。
近日，复旦大学秦晓健、徐文浩和叶定伟共同通讯在Molecular Cancer（IF 33.9）发表文章《Hsa_circ_0038737 promotes PARPi resistance in castration-resistant prostate cancer via IGF2BP3-mediated DNPH1 mRNA stabilization》，揭示了环状RNA hsa_circ_0038737在CRPC中驱动PARPi耐药的全新机制——hsa_circ_0038737作为分子支架在细胞核内与RBP蛋白IGF2BP3结合，提高由IGF2BP3介导的DNPH1 mRNA的稳定性，进而增强肿瘤细胞的DNA损伤修复能力，驱动细胞的PARPi耐药性；而靶向抑制DNPH1能有效逆转由该hsa_circ_0038737介导的耐药性，这为理解circRNA介导的治疗抵抗提供了全新视角。在研究中，研究团队使用了汉恒生物提供的hsa_circ_0038737敲低与过表达慢病毒载体，在22RV1和PC-3中实现了hsa_circ_0038737d的敲低或过表达。
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接下来，我们一起看看本研究的主要结果。
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研究成果
hsa_circ_0038737在前列腺癌中显著上调并与致癌关联
首先，研究者整合了五个独立的公共转录组数据集，发现hsa_circ_0038737在各PCa组织中的表达均显著上调，并通过qRT-PCR和Sanger测序证实了反向剪接位点的存在。随后，通过设计针对其剪接点的发散性和收敛性引物分别扩增cDNA和gDNA，证实该转录本仅能从cDNA中检出而gDNA中缺失，排除了线性基因组污染。放线菌素D处理实验和RNase R核酸外切酶消化实验显示，与线性的GTF3C1 mRNA相比，hsa_circ_0038737在处理后稳定性更高，表现出典型的circRNA特征。核质分离实验与荧光原位杂交实验结果显示，hsa_circ_0038737主要定位于细胞核内，暗示其在转录或表观遗传调控中可能起作用。此外，qRT-PCR验证发现多种PCa细胞系、不同时期前列腺癌组织的hsa_circ_0038737呈现高表达，PCa患者的Gleason评分较高。这些结果表明hsa_circ_0038737作为稳定、核富集、在前列腺癌中显著上调的circRNA，与疾病的恶性进展密切相关。
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图1. hsa_circ_0038737在前列腺癌中显著上调并与致癌关联
Hsa_circ_0038737通过调节细胞周期进程，促进细胞增殖
为了探究hsa_circ_0038737在前列腺癌细胞增殖中的独立功能，研究者分别在22RV1和PC-3细胞中构建了该circRNA的敲低或过表达稳转株。CCK-8检测和克隆形成实验结果显示，敲低hsa_circ_0038737显著抑制了22RV1和PC-3细胞的增殖与克隆形成能力，而过表达则产生了促进作用。研究者进一步通过流式细胞术进行了细胞周期分析，发现敲低该circRNA导致G2期细胞明显积累；而circRNA过表达减少了G2期比例，促进了细胞向M期的进展。这些结果表明，hsa_circ_0038737可能通过加速G2/M进程来正向调控PCa细胞的增殖，这一作用不受其线性宿主基因GTF3C1的影响。
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图2. Hsa_circ_0038737通过调节细胞周期进程，促进细胞增殖
Hsa_circ_0038737通过KH结构域直接与IGF2BP3相互作用
以往的研究发现核定位的circRNA可作为RNA结合蛋白（RBP）的支架发挥调控功能，基于此理论，作者探究了hsa_circ_0038737潜在的RBP伴侣。对pull-down产物进行银染和质谱分析，筛选得到IGF2BP3w为丰度最高的候选RBP，此外，RBPsuite、CircNet、CSCD2数据库的预测结果同样显示，IGF2BP3是hsa_circ_0038737的高置信度结合蛋白。为了验证这一相互作用，研究者在22RV1和PC-3细胞中进行了RNA荧光原位杂交联合免疫荧光共定位实验，发现hsa_circ_0038737和IGF2BP3共定位于细胞核；而IGF2BP3全长和截断体的RIP实验结果确认了二者之间存在物理结合，主要结合区域为IGF2BP3的KH1和KH2结构域。这些结果表明hsa_circ_0038737可在细胞核内通过KH1/2结构域与IGF2BP3形成稳定功能复合物的分子复合物。
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图3. Hsa_circ_0038737通过KH结构域直接与IGF2BP3相互作用
hsa_circ_0038737-IGF2BP3复合物稳定DNPH1 mRNA
接下来，研究者构建了hsa_circ_0038737稳定敲低22RV1细胞株，以阐明hsa_circ_0038737的下游调控机制。RNA测序结果显示下调基因显著富集于mRNA稳定性调控和DNA损伤应答通路，并分析得到DNPH1的mRNA为高置信度靶点。随后的RIP实验在22RV1与PC-3细胞中证实在22RV1和PC-3细胞中证实了IGF2BP3与DNPH1 mRNA的直接结合。敲低或过表达hsa_circ_0038737可分别显著降低或提升DNPH1的mRNA水平；而敲低或过表达IGF2BP3也相应调控了DNPH1的蛋白表达。此外，放线霉素D联合时间梯度衰变分析结果显示，敲低hsa_circ_0038737或IGF2BP3显著降低了DNPH1 mRNA的半衰期，证实了它们在稳定DNPH1转录本中的作用。以上结果表明hsa_circ_0038737作为分子支架促进IGF2BP3蛋白与DNPH1 mRNA的结合，从而增强DNPH1 mRNA稳定性。
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图4. hsa_circ_0038737-IGF2BP3复合物稳定DNPH1 mRNA
DNPH1促进前列腺癌细胞增殖及对PARPi的耐药性
为了研究DNPH1在前列腺癌中的生物学功能，研究者在22RV1和PC-3细胞中将DNPH1过表达与敲低。CCK-8与克隆形成实验表明，过表达DNPH1显著增强了细胞增殖和集落形成能力；针对PARP抑制剂奥拉帕利与尼拉帕利的IC50测定结果表明，敲低DNPH1可显著提高细胞对这两种抑制剂的敏感性；此外，碱性彗星实验检测显示敲低DNPH1导致DNA链断裂显著增加，而过表达均诱导了相反的表型。使用可抑制DNPH1的活性的小分子抑制剂（DNPH1i）N6-苄基腺苷药理模拟基因敲低效果，诱导了高水平的DNA损伤。以上结果表明DNPH1促进PCa细胞增殖，通过减弱DNA损伤调节PARP抑制剂的敏感性。
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图5. DNPH1促进前列腺癌细胞增殖及对PARPi的耐药性
Hsa_circ_0038737通过dnph1依赖机制诱导PARPi耐药
随后，研究者在22RV1和PC-3细胞系中开展了一系列体外药物反应实验。IC50测定显示，敲低hsa_circ_0038737显著增强了细胞对PARPi（奥拉帕利和尼拉帕利）的敏感性，过表达hsa_circ_0038737则使细胞产生明显耐药性，而DNPH1i联合治疗可逆转hsa_circ_0038737过表达诱导的PARPi耐药性。在机制上，研究者进行碱性彗星实验和γ-H2AX（双链DNA断裂标记物）免疫荧光染色，发现敲低hsa_circ_0038737导致DNA损伤显著增加，过表达减少了DNA损伤积累，而DNPH1i共处理恢复了过表达诱导的DNA损伤水平。综上所述，hsa_circ_0038737通过DNPH1依赖性机制提高细胞的耐药型，这一表型可被PARPi有效干预。
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图6. Hsa_circ_0038737通过dnph1依赖机制诱导PARPi耐药
Hsa_circ_0038737通过DNPH1促进体内肿瘤生长和PARPi耐药
为了在体内及临床层面验证hsa_circ_0038737的功能，研究者使用22RV1细胞建立了裸鼠皮下荷瘤模型，实验发现，过表达hsa_circ_0038737显著加速了肿瘤生长并显示出对奥拉帕利的耐药性，而与DNPH1i联合治疗则恢复了肿瘤的药物敏感性，显著抑制肿瘤生长。肿瘤组织的IHC染色实验表明，过表达组肿瘤的DNPH1和Ki-67水平升高，敲低组表达显著下降，这表明该轴在体内增强了增殖和DNA修复能力。在临床相关性方面，对人类前列腺癌组织的IHC检测结果显示，IGF2BP3与DNPH1表达存在显著正相关。此外，使用来自患者的肿瘤类器官进行的药敏实验进一步证实，高hsa_circ_0038737表达的类器官具有奥拉帕利耐药性，DNPH1i可抑制这种耐药性；而低hsa_circ_0038737组则对奥拉帕利敏感。以上结果表明hsa_circ_0038737通过稳定DNPH1驱动肿瘤生长并介导PARPi耐药，且该耐药性可通过DNPH1i有效逆转。
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图7. Hsa_circ_0038737通过DNPH1促进体内肿瘤生长和PARPi耐药
总结
综上所述，本研究探索了Hsa_circ_0038737在前列腺癌发展中的关键作用，发现Hsa_circ_0038737通过与核内RNA结合蛋白IGF2BP3直接互作，进而稳定DNA修复关键因子DNPH1的mRNA，提升肿瘤细胞的DNA损伤修复能力并促进其对PARPi的耐药性，并在细胞、动物模型及患者来源类器官等多个层面上证实了药理性抑制DNPH1可有效逆转由此通路介导的耐药表型。这一研究成果为临床上克服前列腺癌耐药提供了潜在的新靶点，并为联合治疗策略提供了新的理论依据。
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