细胞骨架是真核细胞内由蛋白质纤维构成的三维动态网架体系，由肌动蛋白丝、微管和中间丝组成，在细胞结构稳定性、细胞运动、细胞分裂、细胞内运输以及信号传导等多种细胞功能中发挥着至关重要的作用[1-2]。微丝（又称肌动蛋白丝, F-actin）是由肌动蛋白聚合而成的双螺旋细丝，多分布于细胞膜下，具有高度动态性，主要作为细胞的“肌肉”驱动细胞变形运动（如伪足形成）、吞噬作用及胞质分裂时的收缩环形成，并与肌球蛋白协作实现肌肉收缩。微管蛋白（Tubulin）是细胞内微管的基本结构单位，包括α-Tubulin和β-Tubulin，两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基。微管作为细胞内的“高速公路”，不仅提供刚性支撑以维持细胞形态，还通过马达蛋白介导囊泡与细胞器的定向运输，并在细胞分裂时形成纺锤体牵引染色体分离。中间丝则是由角蛋白、波形蛋白等多种纤维蛋白交织而成的绳索状结构，具有极强的韧性和抗拉伸能力，主要发挥“安全绳”的机械支撑作用，维持细胞及组织的结构完整性并抵抗外界剪切力，同时参与细胞连接和核膜稳定。

图1. 细胞内的三大主要细胞骨架网络：(a) 肌动蛋白丝；(b) 中间纤维；(c) 微管[3]

研究细胞骨架动力学面临的主要挑战包括其高度的动态性、复杂的空间组织以及亚细胞结构的小尺寸[4]。传统的定性分析方法难以应对通过活细胞成像技术产生的大量复杂数据[5]。因此，开发先进的成像技术和示踪工具对于理解细胞骨架功能至关重要。正因如此，科学家们开发了一系列细胞骨架定位病毒工具——利用重组质粒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体，将荧光蛋白精准递送到特定的细胞骨架元件上。这些工具可以在活细胞中，以单分子分辨率实时观察细胞骨架的动态变化等。本文将系统梳理细胞骨架定位工具探针的分类、原理、使用方法及应用案例等。

二、定位工具介绍：荧光标记细胞骨架的利器

1、荧光蛋白

为了在活细胞中“照亮”细胞骨架，研究人员开发了多种荧光标记策略。本文将主要介绍绿光/红光/青光中常用细胞器定位荧光蛋白EGFP/Dsred/mTurquoise2。

EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）是一种经过关键氨基酸突变改造的绿色荧光蛋白，源自水母Aequorea victoria的野生型GFP（avGFP）。EGFP因其亮度高、表达稳定、成熟快速，已成为生命科学研究中应用最广泛的荧光标记工具之一。EGFP的最大激发波长为488 nm，发射波长为507 nm。

Dsred（Discosoma sp.Red fluorescent protein）是一种来自海葵珊瑚的红色荧光蛋白，是继GFP之后最重要的荧光标记工具之一。DsRed具有较高的信噪比，在细胞内荧光转换效率高，更易检测。DsRed的最大激发波长为558 nm，发射波长为583 nm。

mTurquoise2是一种由水母 Aequorea victoria的GFP改造而来的高性能青色荧光蛋白，是目前最亮的单体青色荧光蛋白之一。mTurquoise2不仅具有高荧光量子产率和较长的单指数荧光寿命，同时还具有表达速度快，耐光性强等优势。mTurquoise2的最大激发波长为434 nm，发射波长为474 nm。

2、细胞骨架示踪蛋白

1）标记微丝

LifeAct：酵母ABP140蛋白中的17个氨基酸的小肽，能特异性结合纤维状肌动蛋白（F-actin），而不干扰肌动蛋白的动态聚合，已被证明是活细胞微丝成像的“金标准”。

图2. 荧光图像显示mTur-Lifeact蛋白在hela细胞中正常表达并准确定位[6]

UtrCH (Utr261 / Utr230)：来源于Utrophin的串联钙调蛋白同源结构域（Calponin Homology Domain）。UtrCH探针在结合F-actin时不会稳定肌动蛋白丝（不抑制其解聚），因此能忠实地反映活细胞和固定细胞中F-actin的分布，且对依赖肌动蛋白组装/解聚平衡的细胞过程无明显影响。

F-tractin：来源于大鼠ITPKA中的肌动蛋白结合肽。在常见的活细胞探针中，F-tractin 的细胞内分布与鬼笔环肽（Phalloidin，传统的F-actin染色金标准）最为相似。

β-actin：将全长β-肌动蛋白与荧光蛋白融合，更接近生理状态，但可能掺入肌动蛋白丝影响动力学。

表1.微丝定位探针的区别

图3. 比较不同肌动蛋白定位的荧光图[7]

2）标记微管（Microtubules）

微管蛋白Tubulin：将α-Tubulin或β-Tubulin与荧光蛋白融合。转导后，标记的微管蛋白亚基会掺入聚合的微管中，清晰显示整个微管网络。

图4. 荧光图像显示α-Tubulin蛋白在hela细胞中正常表达并准确定位[6]

用于示踪微管的除微管蛋白外，还有微管相关蛋白（MAPs）主要可分为两大类：一类是特异性追踪微管生长正端的微管正端追踪蛋白（+TIPs），另一类是结合在微管侧壁上的晶格结合蛋白（Lattice-binding MAPs）。

微管正端追踪蛋白（+TIPs）：专门靶向微管的生长端（正端），在活细胞成像中通常呈现动态的“彗星尾”状，是研究微管聚合速率、动态不稳定性和生长方向的金标准工具。

EB1 / EB3：最经典的+TIPs蛋白，结合在微管生长的正端，常用于微管生长动力学的实时监测。CLIP-170：最早被鉴定出的+TIPs，能够动态追踪微管正端，并介导微管与细胞器的互作。XMAP-215：微管稳定和生长促进蛋白，能够靶向微管的生长端，调节微管的聚合。

晶格结合蛋白（Lattice-binding MAPs）：沿着微管丝的长度方向（侧壁）结合，而不是集中在正端或负端，因此非常适合用于标记整个微管网络的静态或整体形态。

Tau：主要分布在动物神经元轴突中，通过其带正电的结构域侧向结合微管表面，起到稳定微管的作用。MAP2：主要分布在神经元的树突中，同样属于晶格结合蛋白，常与 Tau 一起用于研究神经细胞的形态结构。MAP4：与局限于神经细胞的Tau和MAP2不同，MAP4 广泛存在于几乎所有类型的细胞中，负责微管的稳定。

3）标记中间丝（Intermediate Filaments）

Vimentin：波形蛋白是间充质细胞中最主要的中间丝蛋白。能准确标记Vimentin网络，适用于研究细胞机械应力和迁移。

图5. 中间丝与微管网络的关联定位，波形蛋白中间丝（VIF）[8]

三、微管定位工具的检测

细胞骨架定位探针蛋白和荧光蛋白融合表达用于细胞骨架定位的质粒/慢/腺/腺相关病毒，既可用于体外细胞实验，也可用于体内动物实验。通过激光共聚焦显微镜在融合荧光的激发和发射波长下观察细胞骨架的定位和形态，用于细胞骨架的可视化研究，细胞骨架各组分的具体形态区别见表2。

表2. 细胞骨架的主要形态

（1）活细胞成像：适用于动态追踪微管的状态、分裂和转移等实时行为。将感染后的细胞置于激光共聚焦显微镜下。针对微管的活细胞成像，要特别注意光毒性问题，通过降低激光功率、缩短曝光时间等来控制光毒性的影响。

（2）固定细胞成像：适用于形态统计与共定位分析。通常使用4%多聚甲醛室温固定15分钟，PBS洗涤后封片（使用抗荧光淬灭的封片剂），即可在共聚焦显微镜下观察。

四、细胞骨架示踪应用案例

案例1：微管示踪

文章标题：Genetically Encoded Microtubule Binders for Single-Cell Interrogation of Cytoskeleton Dynamics and Protein Activity

示踪工具：OligoMT和OligoTIP两种遗传编码的寡聚微管结合剂（+TIPs 蛋白）

使用方法：将HeLa细胞培养在35 mm玻璃底板上。当细胞密度达到60%-80%时，使用Lipofectamine 3000转染mCh-OligoMT或mCh-OligoTIP。转染后18小时，固定渗透，DAPI染色，在共聚焦显微镜下进行成像。OligoMT用于标记微管细胞骨架，而OligoTIP则可用于活细胞监测微管加号端。

图6. OligoMT设计用于微管细胞骨架的实时可视化[9]

图7. OligoTIP设计用于微管加号端的实时跟踪[9]

案例2：微丝示踪

文章标题：基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法

示踪工具：LifeAct-HaloTag N或者LifeAct-HaloTag C

使用方法：使用双分子荧光互补分裂的HaloTag蛋白融合LifeAct在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中标记纤维状微丝骨架，所使用的染料为小分子透膜染料Janelia 549。图B为使用鬼笔环肽在同一固定的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中标记纤维状微丝骨架的荧光图，所使用的染料为Alexa Fluor 488。图C为A和B通道的叠加荧光图，可以看出A和B两个通道完全共定位，这表明使用双分子荧光互补标记细胞微丝骨架的新方法所标记的结构确实为纤维状微丝骨架。

图8. 双分子荧光互补标记细胞微丝骨架与使用鬼笔环肽标记的微丝骨架完全共定位[10]

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表3.细胞骨架相关产品汇总

参考文献：

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